RP-HPLC法测定苍耳子中苍术苷

刘玉红，朵 睿，2，黄 蛟，王明奎，易进海*

（1.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；2.泸州医学院，四川 泸州，646000；3.中国科学院成都生物所，四川 成都 610041）

苍耳子是菊科植物苍耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟带总苞的果实，具有散风寒、通鼻窍、祛风湿之功效，用于风寒头痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊等症，是鼻渊之要药［1］，为临床常用有毒中药。《本草品汇精要》记载苍耳子“有毒”。《南方主要有毒植物》记载: “苍耳，有毒部位，全株；以果实为最毒”。因苍耳服用过量或炮制不当引起的中毒甚至死亡的病例时有发生［2-3］，病理特征表现为动物和人在误食一定量后出现血糖下降，昏迷，严重者出现肾衰竭甚至死亡；慢性中毒多因初服时未出现明显的不良反应而长期服用，结果导致蓄积中毒，引起心肌及肝功能损害［4］。现代化学和毒理研究表明苍耳子的毒性成分主要为水溶性苷类成分:苍术苷(atractyloside)与羧基苍术苷(carboxyatractyloside)以及其它苷类衍生物等［5］。苍术苷及羧基苍术苷可抑制体内ADP/ATP对蛋白的转运，并带来严重的血糖下降，从而导致体内代谢紊乱［6-8］，与苍耳子中毒的表现一致，因此被认为是苍耳子的主要毒性成分。建立苍耳子中苍术苷的测定方法，对苍耳子的毒性成分进行监控，保证临床用药安全是十分必要的。苍耳子中苍术苷的测定尚未见文献报道，其它样品中苍术苷的测定方法文献报道有酶联免疫法［9］、TLC斑点测试［10］、GC-MS［11］、HPLC-ELSD［12］、LC-API-MS［13］等，这些方法在定量的准确性或方法的普适性方面存在一定的局限。本实验首次建立了RP-HPLC测定苍耳子中苍术苷的方法，该方法简便、快速，重复性好，为控制苍耳子的质量和毒性提供了参考。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色谱仪 (包括四元泵，DAD检测器，柱温箱，自动进样器，工作站)；KQ—100超声波清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司)，Mettler Toledo XS205型电子天平 (瑞士)，Millipore Milli-Q超纯水系统 (美国)。

实验样品购于四川、辽宁、山东、河北、内蒙古、新疆、甘肃等地共35批苍耳子药材和饮片，由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定。苍术苷对照品自制，纯度为98.1%，经理化性质和光谱数据分析，鉴定其结构。乙腈为美国Fisher色谱纯；水为Millipore Milli-Q超纯水系统制得的超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流动相为乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液 (20∶80)；体积流量1.0 mL/min；检测波长203 nm；柱温35℃。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。同时对样品中苍术苷的200～400 nm紫外光谱图与对照品的紫外光谱图进行比较，表明样品峰无其它杂质干扰。

图1 苍术苷对照品 (A)及苍耳子供试品 (B)的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of atractyloside(A)and Xanthii Fructus(B)

2.2 对照品溶液的制备 精密称取苍术苷对照品11.29 mg，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取上述对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中含苍术苷0.1129 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取苍耳子粉未 (过三号筛)1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水20 mL，精密称定质量，超声 (功率250 W，频率40 kHz)处理40 min，取出，放冷，再称定质量，用水补足减失质量，离心 (12000 r/min，5 min)，取上清液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系 精密吸取苍术苷对照品各1、3、6、9、12、15、20 μL，注入液相色谱仪中，以进样量 (μg)为横坐标，对照品峰面积 (A)为纵坐标，绘制标准曲线。结果苍术苷的标准曲线为Y=458.9X-3.884(r=0.9999)，线性范围为0.1129 ～2.258 μg。

2.4.2 定量限和检出限 将2.2项下的溶液，用10%甲醇溶液稀释成0.01129 mg/mL的溶液，进样测定，按10倍和3倍信噪比计算出苍术苷的定量限和检出限分别约为34 ng、11.3 ng。

2.4.3 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(样品01)10 μL，注入液相色谱仪，连续进样5次，按2.1项下色谱条件测定，苍术苷的峰面积的RSD为0.58%，表明仪器精密度好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(样品01)10 μL，注入液相色谱仪，分别于0、1、4、8、24 h检测，记录色谱图，苍术苷的峰面积的RSD为0.83%，表明供试品溶液于24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一苍耳子 (样品01)粉未，精密称取约1 g，共5份，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算出苍术苷质量分数为2.14 mg/g、RSD为1.0%，表明该方法重复性好。

2.4.6 加样回收试验 取已知苍术苷含有量的样品 (样品01，2.14 mg/g)，0.5 g，共6份，精密称定，准确加入适量对照品，照2.3项下操作，测定，计算回收率。结果见表1。

表1 苍术苷的加样回收率实验 (n=6)Tab.1 Recovery of atractyloside

2.5 样品测定 照2.3项下方法制备35批次苍耳子样品的供试品溶液，分别精密吸取10～20 μL注入液相色谱仪测定，在2.1项色谱条件下进行测定，计算各样品中苍术苷，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂和样品制备方法的考察 苍术苷为水溶性苷类。本实验比较了水、25%甲醇、50%甲醇对苍术苷超声提取的效果，3种溶剂测定同一样品的含有量分别为0.214%、0.191%，0.0723%，表明不同溶剂提取对苍术苷有显著影响，以水提取效果最佳。又以水为提取溶剂，比较了超声提取30、40、60 min的差异，结果表明提取 40 min即可。

表2 苍耳子样品中苍术苷的测定结果 (n=3)Tab.2 Contents of atractyloside in Xanthii Fructus

3.2 色谱条件的选择和优化

3.2.1 流动相系统的筛选 参照文献［13］，采用甲醇-醋酸盐缓冲液系统，结果基线噪音太大，该系统不适合紫外检测器短波长检测。又自行摸索比较了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸盐等系统，结果以乙腈-磷酸盐系统较好，但仍存在色谱峰拖尾严重的问题，故对不同色谱柱的分离效果进行比较。

3.2.2 色谱柱的筛选 比较了Phenomenex LUNA C18(2)(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，Agilent Eplise XDB-C18柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，亲水性C18柱 Phenomenex Gemini C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)，苯基柱 Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)的分离效果，结果以苯基柱分离效果最佳，峰形较为对称。

3.2.3 测定波长的选择 苍术苷为贝壳杉烯苷类化合物，DAD扫描可见仅有末端吸收，故采用203 nm为测定波长，结果表明灵敏度较高，待测成分基线分离，重现性良好，符合定量测定的要求。

3.3 测定结果 35批次苍耳子药材及饮片的测定结果，表明不同来源苍耳子中苍术苷的含有量差异很大，有必要制定苍术苷的限量标准。有报道称南方产苍耳子低毒，北方产苍耳子毒性较大，本实验测定结果与此结论有相同趋势。

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