雌激素改善大鼠记忆及促进海马BDNF蛋白表达上调

唐明山

（重庆市巴南区人民医院神经内科 401320）

雌激素改善大鼠记忆及促进海马BDNF蛋白表达上调

唐明山

（重庆市巴南区人民医院神经内科 401320）

目的探讨雌激素改善大鼠记忆与BDNF表达的关系。方法停止繁殖的15月龄雌性大鼠，体质量350～400g，随机分为治疗组和对照组，在颈部皮下分别注射相同剂量的苯甲酸雌二醇和生理盐水。采用Morris水迷宫检测大鼠记忆，大鼠海马BDNF、TrkB及mRNA表达采用RT－PCR检测，BDNF、TrkB及proBDNF蛋白表达采用Western－blot检测。结果治疗组大鼠潜伏期缩短，海马BDNF、TrkB、proBDNF表达上调（P＜0.01）。结论雌激素改善大鼠记忆，可能与BDNF及相关蛋白表达上调有关。

雌激素；记忆；脑源性神经营养因子

研究表明，脑源性神经生长因子（brain－derived nerve growth factor，BDNF）与学习记忆有关［1－2］，BDNF是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内。有关运用雌激素改善记忆的研究颇多，尽管结论不一，多数研究认为，绝经后妇女血浆雌激素水平降低可能使认知功能恶化［3］，至少在绝经后特定的时间窗内，雌激素替代治疗能改善认知功能［3－4］。有关雌激素改善认知功能的机理尚不清楚，结合BDNF与记忆的关系，本研究观察雌激素治疗后大鼠海马BDNF、高亲和受体酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）和BDNF前体蛋白（precursor protein of brain－derived neurotrophic facton，proBDNF）表达的变化，了解其与大鼠记忆改变的关系，探讨雌激素替代治疗影响绝经后大鼠认知功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 93只清洁级Sprague－Dawley雌性大鼠，15月龄左右，已自然停止繁殖2个周期，体质量350～400 g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。随机分为治疗组和对照组，每组各35只，备用8只（每组4只），7只在手术中或术后死亡。每组在7d和30d两个时相点进行观测。

1.2 模型制备 先将所有大鼠在实验前放入不放置水下平台的水迷宫中游泳4次（上下午各2次），剔除原地打转的大鼠8只后，随机分为雌激素替代治疗组及对照组。模型制备按有关文献［5］，雌激素替代治疗组切除双侧卵巢，对照组按相同方法打开腹腔，找到卵巢后不切除卵巢，关腹。所有手术操作均由同一实验人员完成，避免不同人员操作引起的误差。两组大鼠于相应时相点取材或行有关实验。

1.3 动物饲养 手术完毕后的实验动物在第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心按组分笼喂养，每组每笼对编号、组别、数量、手术时间进行标识，5只大鼠为一笼进行喂养，饲料由动物实验中心提供普通大颗粒饲料，按每200g标准体质量大鼠每天进食15g干饲料匡算，限量分笼投食，自由饮水，每天07：00～19：00保证光照12h，定时通风，每日早、晚冲洗大鼠排泄物，空调调节室温，使室温保持在17℃～23℃。

1.4 给药方法 实验动物术后恢复1个月，从第17月龄开始，每日治疗组大鼠颈部皮下注射苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate，EB）25mg·kg－1·d－1［6］，对照组大鼠颈部皮下注射相同剂量生理盐水。为保持大鼠血浆雌二醇浓度，避免雌二醇波动引起的认知功能检查的误差，水迷宫实验阶段每日仍按上述方法进行苯甲酸雌二醇或生理盐水注射。

1.5 记忆功能检测 采用中科院研制生产的Morris水迷宫（morris water maze，MWM）3.0对大鼠记忆功能检测。实验前1d为观察其游泳姿势及熟悉环境，让大鼠自由游泳2min。训练开始时，将平台置于NW象限，将大鼠面向池壁从池壁4个起始点的任一点放入水池，入水后系统自动录像记录游泳路径（swimming pathlength）和大鼠找到平台的游泳时间即逃避潜伏期（escape latency），每天分上、下午两个时间段（blocks），每个时间段训练2次（trials），实验历时5d，每次大鼠爬上或被引到平台后，在平台上休息30s。同一次训练的全部大鼠采用相同的入水点，每次训练选取不同入水点。大鼠训练过程由系统自动记录，在规定时间内找不到平台的大鼠，即将其引导到平台，系统自动中止记录，并将潜伏期计为150s。训练结束立即撤出平台，进行空间搜索实验，150s内大鼠在穿越原平台次数、游泳时间百分比、在平台象限游泳距离、大鼠的搜索策略。

1.6 分子生物学指标 BDNF、TrkB、mRNA：采用半定量（RT－PCR）检测。全部引物由上海生工合成，BDNF引物序列：上游5′－AGC CTC CTC TGC TCT TTC TGC TGG A－3′，下游5′－CTT TTG TCT ATG CCC CTG CAG CCT T－3′；TrkB 引物序列：上游5′－ATT GAC CCA GAG AAC ATC AC－3′，下游5′－CAG GAA ATG GTC ACA GAC TT－3′；GADPH 为内参照。proBDNF、BDNF及TrkB蛋白：采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测。一抗分别采用Chemicom International公司的兔抗鼠proBDNF（AB5613）及Santa Cruz Biotechnology公司的兔抗鼠 BDNF（N－20）：sc－546、兔抗鼠 TrkB，二抗采用Sigma公司的山羊抗兔IgG，采用美国DUPONT的化学增强发光试剂盒（western blot chemiluminescence reagent plus）。操作按分子生物学实验操作第2版进行。

1.7 统计学处理 实验数据釆用SPSS12.0统计软件进行分析。所有计量资料采用±s表示，组内均数的显著性检验釆用单因素方差分析（one way ANOVA），组间均数的显著性检验釆用独立样本的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 雌激素能促进绝经后大鼠海马表达BDNF mRNA和TrkB mRNA扩增结果 GADPH片断长度为598bp，BDNF扩增片断长度为297bp（图1），TrkB扩增片断长度为467bp（图2）。

图1 大鼠海马BDNF mRNA扩增产物

图2 大鼠海马TrkB mRNA扩增产物

以GADPH内参照单位密度值为10D/mm2，结果经图像扫描分析，校正后显示：治疗组大鼠海马BDNF和TrkB mRNA明显高于对照组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），组内不同时相点比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 大鼠海马BDNF、TrkB mRNA相对积分光密度（±s）

表1 大鼠海马BDNF、TrkB mRNA相对积分光密度（±s）

＊：P＜0.05，与对照组同时间段比较。

组别 时间（d）BDNF TrkB对照组7 0.722±0.047 0.801±0.030 30 0.651±0.096 0.732±0.050雌激素治疗组 7 1.006±0.011＊1.175±0.015＊30 0.999±0.015＊1.166±0.018＊

2.2 雌激素能调节绝经后大鼠海马proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表达 免疫印迹结果显示，TrkB、proBDNF和BDNF蛋白免疫印迹蛋白相对分子质量各为30、14和145kD，结果见图3～5。

图3 大鼠海马BDNF前体及成熟蛋白表达结果（Western blot）

图4 大鼠海马BDNF前体蛋白表达结果（Western blot）

图5 大鼠海马TrkB蛋白表达结果（Western blot）

以对照组7d这一时相点单位密度值为10D/mm2，结果经图像扫描分析，校正后显示：雌激素治疗组海马组织proBDNF、BDNF及TrkB表达水平均明显高于对照组大鼠（P＜0.05），组内不同时相点差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 血浆雌二醇水平比较 大鼠血浆雌二醇浓度在雌激素治疗7d组为（66.92±10.78）pg/mL，大鼠血浆雌二醇浓度在对照组相应时相点为（3.87±1.94）pg/mL；大鼠血浆雌二醇浓度在雌激素治疗30d组为（64.89±10.09）pg/mL，大鼠血浆雌二醇浓度在对照组相应时相点为（5.54±2.37）pg/mL，组内时相点比较差异无统计学意义（P＞0.05），两组组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 海马proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表达（±s）

表2 海马proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表达（±s）

＊：P＜0.05，与对照组同时间段比较。

组别 时间（d） proBDNF BDNF TrkB对照组7 1.000 1.000 1.000 30 0.951±0.096 1.032±0.050 1.131±0.030雌二醇治疗组 7 2.006±0.011＊1.579±0.015＊1.975±0.015＊30 2.099±0.015＊1.661±0.018＊2.166±0.018＊

2.4 两组大鼠水迷宫试验成绩比较 两组大鼠定位航行实验经过水迷宫训练后游泳速度比较差异无统计学意义（P＞0.05）；组内不同时相点间大鼠游泳速度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。说明绝经后大鼠的游泳速度并不能被雌激素替代治疗改善。对两组大鼠潜伏期比较，治疗组找到平台的潜伏期小于对照组（P＜0.05），治疗30d的大鼠潜伏期小于治疗7d的大鼠（P＜0.05）。说明治疗组大鼠记忆力强于对照组，治疗30d的记忆力更强（表3）。

表3 雌激素对大鼠定位航行实验的影响（±s）

表3 雌激素对大鼠定位航行实验的影响（±s）

＊：P＜0.05，与对照组同时间段比较；★：P＜0.05，与组内7d时比较。

对照组 雌二醇治疗组项目n7d 30d潜伏期（s） 10 16.39±4.76 17.06±5.24 12.01±3.18＊8.34±3.03 7d 30d＊★10.75游泳速度（cm/s） 10 35.18±10.2133.52±9.21 34.96±9.54 36.07±

3 讨 论

本研究中，雌激素治疗组手术后给予雌二醇治疗后，治疗组体内雌激素水平高于对照组，大鼠找到平台的潜伏期较对照组短，说明治疗组大鼠对平台的记忆比对照组好，雌激素治疗改善了大鼠记忆功能。与Kiss等［7］的研究相符。研究中选取已经绝经的大鼠，主要考虑其雌激素水平较低，即使对照组假手术未切除卵巢，其体内雌激素的水平与治疗组给予的雌二醇量比较可以忽略不计，实验结果能反应雌激素对大鼠记忆的影响。

对雌激素替代治疗改善认知功能的机制，研究认为雌激素可能通过抗凋亡、抗氧化、阻止淀粉样斑的产生及促进神经营养因子分泌［8］，来影响认知功能。有研究表明，大脑中BDNF表达受月经周期影响［9］，提示BDNF的表达受雌激素影响。有关记忆的研究表明，记忆与突触前和突触后的长时程增强效应（long－term potentiation，LTP）明确相关，BDNF能调节突触传递和突触可塑性，改变LTP［10］，增强学习记忆功能。因此，在某种程度上，BDNF可作为记忆改善的分子标志物。

本研究中，雌激素治疗组大鼠BDNF基因及蛋白表达均明显上调，雌激素可能通过促进BDNF表达来影响大鼠的记忆。本研究中，治疗组30d时相点大鼠与7d时相点大鼠比较，BDNF的基因和蛋白水平表达并未上调，其体内雌激素浓度也无显著差异，说明雌激素与BDNF表达一致。治疗组定位航行的结果中，30d组大鼠潜伏期比7d组大鼠短，说明30 d组大鼠记忆好于7d组。分析原因：（1）可能是手术创伤对大鼠游泳速度有影响，30d大鼠手术恢复较好，受手术本身的影响较小。（2）一定时间内雌激素持续替代治疗时间的长短可能对记忆有一定影响。另外，大鼠的记忆可能还存在其他机制。

BDNF需与其受体结合才能发挥作用，因此，研究BDNF的表达离不开其高亲和力受体TrkB，BDNF需要与其结合才能发挥作用，二者在海马中表达均较高，它们结合后，使TrkB络氨酸残基自磷酸化，促发细胞内信号传导通路，调节LTP［11］，影响学习记忆。TrkB的基因及蛋白表达上调均与BDNF一致，结果从另一方面表明，BDNF及受体TrkB蛋白表达上调，是雌激素记忆的可能机制。在神经元突触中，BDNF由其前体蛋白proBDNF而来［12］，因此，本研究也检测了两组大鼠海马proBDNF蛋白表达，结果发现，雌激素治疗组大鼠proBDNF蛋白增强，与BDNF成熟蛋白表达一致。proBDNF蛋白表达增强也从另一方面表明雌激素能促进BDNF表达，改善学习记忆功能。

本实验中，雌激素替代治疗能改善绝经后大鼠记忆功能，促进BDNF、高亲和力受体TrkB及proBDNF蛋白表达，这些蛋白表达的增强，可能是雌激素改善记忆的分子机制之一。

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Estrogen to improve rat memory and hippocampal BDNF protein expression upregulation

TangMingshan
（DepartmentofNeurology，theFirstPeople′sHospitalinBa＇nanDistrict，Chongqing401320，China）

ObjectiveTo explore the relation of estrogen on memory and expression of BDNF in hippocampus of postmenopausal rats.MethodsRats retired from breeding for two reproductive cycles，15－month－old，and 350－400g weight，were divided into two groups by random assigned method.Before testing，estradiol benzoate and the same capacity of normal saline was injected subcutaneouly on the cervical part of rats.memory of rats was detected by Morris water maze.RT－PCR and Western－blot wre respectively used to detect expression of BDNF mRNA，TrkB mRNA and protein of BDNF，TrkB and proBDNF hippocampus of postmenopausal rats.ResultsCompared with the control group，the rats of estrogen replacement therapy group showed a shorter escape latency（P＜0.05）Contrasted to the control group，expression of BDNF，TrkB and proBDNF protein in hippocampus increased（P＜0.05）.ConclusionMemory is enhanced in the rats received estrogen replacement therapy group in postmenopausal rats，it maybe related with high expression of BDNF and relational protein.

estrogen；memory；brain－derived nerve growth factor

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.016

A

1671－8348（2012）23－2386－03

2012－01－18

2012－02－28）