口服PHA复合物对犬瘟热疫苗免疫效果的影响

郭守兴 （云南省普洱市景谷县动物卫生监督所 666400） 沈学文 （云南省红河州动物疫病预防控制中心 蒙自） 肖啸 （云南农业大学动物科学技术学院 昆明）



口服PHA复合物对犬瘟热疫苗免疫效果的影响

郭守兴 （云南省普洱市景谷县动物卫生监督所 666400） 沈学文 （云南省红河州动物疫病预防控制中心 蒙自） 肖啸*（云南农业大学动物科学技术学院 昆明）

试验通过选择12只健康幼犬，随机分成对照组和试验组，每组6只。试验当天进行免疫接种，试验组每只皮下注射1头份犬瘟热-犬细小二联苗，同时口服PHA复合物0.1mg/kg，对照组每只皮下注射1头份二联苗。各组在接种前及接种后7、14d，分别采血用CDV-Ab金标试纸条测定其抗体滴度，计算阳转率并进行T检验：接种后7d，对照组阳转率为33.3%，试验组阳转率为66.7%，试验组与对照组相比，阳转率提高约2倍；接种后14d，对照组抗体滴度平均水平为1:22.5，试验组抗体滴度的平均水平为1:45。对照组阳转率为66.7%，试验组阳转率为83.3%，试验组比对照组相提高了16.6%。T检验结果显示，试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。试验组抗体离散度缩小，在1:64~1:128之间波动。试验表明：PHA复合物可明显提高幼犬对犬瘟热疫苗的抗体应答能力，是一种良好的犬瘟热疫苗免疫增效剂。

PHA复合物 犬瘟热疫苗 免疫效果

植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)是一种从红芸豆中提取的有丝分裂原，是由D-甘露糖、氨基葡糖醛酸衍生物所构成的低聚糖辅基与蛋白质复合物，PHA有促进淋巴细胞有丝分裂、激活淋巴细胞的作用。是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素，还可以刺激机体产生非特异性抗体[1]。据美国《Science》杂志报道，机体免疫系统通过识别PHA而识别病毒，并产生相应的抗体和其他免疫反应，以从体内清除病毒[2]。PHA与黄芪多糖等多种中草药联用具有增效作用，与部分抗生素联用具有相加作用。植物血凝素作为天然的免疫细胞激活剂具有毒副作用小、安全范围大、无种属特异性、不易产生耐药性、不易产生过敏反应、无残留、生物利用率较高的特点[3]。

由于PHA强大的增强机体非特异性免疫力的作用以及强效的抗病毒作用，其作为一种新型的天然广谱抗病毒药物在畜牧养殖业中应用广泛。在兽药中的应用也日益广泛。

PHA也具有多种免疫效应：能刺激多种淋巴细胞分裂增殖，是多克隆激活剂；能促进淋巴细胞释放细胞因子，如IFN-γ、IL-2等；同时PHA可促进抗体形成，这些结果证明PHA具有强大的免疫增强作用[4]。

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接触传染性、致死性传染病，是当前影响养犬业发展的最严重的第一大传染病。幼犬出生8周左右，其血清中的抗体滴度大多已经低于免疫保护所需要的水平，必须尽快接种犬瘟热疫苗。接种犬瘟热疫苗后一般需要2周才能达到免疫保护所需要的中和抗体水平。幼犬在出生8周左右最易感染犬瘟热，为使幼犬接种犬瘟热疫苗后尽快产生抗体并达到免疫保护所需要的抗体水平，以及缩短幼犬易感期，特进行了此试验。

目前，有关口服PHA对犬瘟热病毒免疫效果影响的研究鲜见报道，本试验通过对健康犬注射犬瘟热-犬细小二联苗，同时口服PHA复合物，测定犬免疫效果的变化，以研究PHA是否对犬瘟热病毒免疫效果产生影响，以期为PHA在动物方面的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 本次试验所用的12只健康犬均由康大妈流浪狗收容所提供，所有接种疫苗的犬均无过往疾病史，精神状态良好，经检测抗体水平符合接种条件，不符合的均已被剔除。试验前、后均按正常方式饲养，环境、饲料不变。

1.1.2 试验药物 PHA复合物(云南大理金明动物药业有限公司生产，生产批号20100101)、犬瘟热-犬细小二联苗(荷兰英特威公司生产，生产批号A063A01)。

1.1.3 试验仪器及试剂 真空贮血管(5ml，无抗凝，江西格兰斯医疗器械有限公司)；采血针(江西洪达医疗器械集团有限公司)；离心机(上海手术器械厂)；CDV-Ab金标试纸条(韩国安捷公司，内有稀释缓冲液1瓶，吸液塑料管1支)

1.2 试验方法

1.2.1 试验分组 将12只年龄、体重相近的健康犬随机分成对照组和试验组2组，每组6只。试验组提前1周喂服PHA复合物0.1mg/kg体重，1次/d，连续给药5d，1周后，试验组与对照组同时接种免疫，每只试验犬皮下注射1头份英特威二联苗，疫苗接种后试验组继续投药，方法剂量与前次相同，连用5d，1周后，再按之前的方法再次给药5d。整个过程，对照组均不做给药处理。各试验犬均按正常方式管理、饲喂。

1.2.2 血样的采集和处理 试验为期3周，各组在免疫接种前及接种后7、14d，分别前肢静脉采血3ml，将所采血样分组编号，用离心机4000转离心5min，分离出血清。

1.2.3 抗体滴度的测定 血清处理后用CDV-Ab金标试纸条测定其抗体滴度：用包装内的塑料吸管吸取适量血清，滴入稀释缓冲液中，混合均匀，吸取混合液，在试纸条的加样孔里滴加3至4滴，室温静置20min，比较T线与C1、C2线的线条宽度与颜色深浅(注释：稀释缓冲液中含有少量的叠氮钠作为防腐剂，该药物有毒性，必须小心处理并且避免皮肤接触)。

1.2.4 试验结果判定 CDV-Ab金标试纸条判定：①C1线为低抗体水平测量对照线，抗体水平相当于1:16，C2为高抗体水平测量对照线，相当于1:128的抗体水平。②如果T线的线条宽度和颜色深浅弱于C1线，那血清的抗体水平判定就以C1为准，具体方法是：如果T线不出现，则该血清抗体水平为0，如果T线线条宽度和颜色深浅是C1线的1/4，则抗体水平为1:2，是C1线的1/3则抗体水平为1:4，是C1线的1/2时，抗体水平为1:8，如果与C1相近则为1:16。③如果T线的线条宽度和颜色深浅强于C1线而弱于C2线，则该血清的抗体水平判断就以C2线为准，具体方法是：如果T线线条宽度和颜色深浅是C2线的1/3，则抗体水平为1:32，如果是1/2，则抗体水平为1:64，如果与C2相近则为1:128，其中1:32的抗体水平为临界值，1:64以上为合格。

1.2.5 数据分析 采用SPSS统计软件，按照生物统计学上的分析方法对检测的各组数据进行统计学处理和分析，P<0.05表示差异显著和P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 接种前对照组和试验组的抗体滴度水平

表1 接种前对照组组与试验组组的抗体滴度水平

由表1可知，接种犬瘟热-犬细小二联疫苗前，对照组与试验组犬的抗体滴度水平基本相同，平均值皆为1:3，两组的犬瘟热抗体阳转率都为0。T检验显示两组间差异不显著(P>0.05)。

2.2 免疫接种后7d对照组和试验组的抗体滴度水平

表2 免疫接种后7d各组的抗体滴度水平

由表2可知，接种疫苗后7d，试验组抗体滴度的平均水平达到1:29.5，比对照组提高了48.14%。对照组阳转率为33.3%，试验组阳转率为66.7%，试验组与对照组相比，阳转率提高约2倍。T检验结果显示，试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

2.3 免疫接种后14d对照组和试验组的抗体滴度水平

接种疫苗后14d，对照组抗体滴度平均水平为1:22.5，试验组抗体滴度的平均水平达到1:45。对照组阳转率为66.7%，试验组阳转率为83.3%，试验组比对照组相提高了16.6%(见表3)。T检验结果显示试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。试验组抗体离散度缩小，在1:64~1:128之间。

表3 免疫接种后14d各组的抗体滴度水平

3 讨论

据报道，目前有许多研究表明PHA可以与疫苗同时使用，能起到弥补免疫空白期、减缓疫苗应激反应、增强免疫效果的作用。莫非等人研究了植物血凝素(PHA)对鸡免疫功能的影响，结果表明PHA对机体的细胞免疫和体液免疫均有较强的促进作用，PHA对人工感染鸡新城疫病毒有保护力[5]。陈东明等(2006)[6]报道利用PHA增强了小鼠特异性体液免疫的效应。张明珠等(2009)[7]在试验植物血凝素对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响中，采用滴鼻的途径，对肉用雏鸡进行新城疫Ⅳ系苗免疫接种过程中，同时辅助使用植物血凝素(PHA)，可明显提高机体特异性抗体的水平，因而能够有效地增强鸡新城疫疫苗的免疫效果。

通过对健康犬注射犬瘟热-犬细小二联苗，同时口服PHA复合物，测定犬免疫效果的变化，发现在免疫接种前2组抗体滴度水平基本相同，无免疫保护作用。接种疫苗后7d，对照组阳转率为33.3%，试验组阳转率为66.7%，试验组与对照组相比，阳转率提高约2倍。试验组抗体滴度的平均水平比对照组提高了48.14%。到免疫接种后14d，试验组抗体滴度的平均水平为1:45，达到了保护犬免受犬瘟热病毒感染所需的基础抗体滴度水平(1:32)。阳转率试验组与对照组相比提高了16.6%，且T检验结果显示，试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。试验组抗体离散度缩小，在1:64~1:128之间。这表明给犬免疫注射犬瘟热-犬细小二联苗的同时，口服0.1mg/kg PHA复合物，可促进机体对疫苗株感染做出免疫应答，对幼犬抵抗犬瘟热病毒的攻击可能起到积极的预防作用，由此显示PHA可以作为高效免疫增强剂与疫苗合用来提高疫苗的免疫效果。

接种疫苗后14d，对照组阳转率为66.7%，试验组阳转率为83.3%，效果不明显，为了加强免疫效果还要进行二免，甚至三免。提高幼犬对犬瘟热病毒病的抵抗力。

肖啸等(2011)[8]给不同试验组猪肌注低剂量(0.2ml/kg)、中剂量(0.4ml/kg)、高剂量(0.8ml/kg)的PHA，结果发现，与对照组相比，低剂量组和中剂量组淋巴细胞都有了不同程度的提高，但中剂量组提高的较高，显示适量的PHA能显著地促进淋巴细胞提高，增强免疫功能。另有学者报道，PHA对鸡新城疫，猪圆环病毒病、猪传染性胃肠炎、非典型猪瘟等有免疫促进作用[9,10]，与本研究的结果基本一致。在实际免疫中，为更好地抵御犬瘟热病毒的感染，还需要在首次免疫后的2~3周进行加强免疫。本试验因条件限制，未能开展攻毒和中和试验，以及不同剂量梯度的对比试验，所以对免疫保护时间能提前多少天，最适宜的口服剂量等问题，还有待进一步研究。

4 结论

（1）对犬注射犬瘟热-犬细小二联苗，同时口服一定剂量PHA复合物，能极显著提高机体抗体滴度水平，阳转率也得到较大提高，且离散度明显缩小，免疫效果更好。（2）给犬免疫注射犬瘟热-犬细小二联苗，同时口服PHA复合物，可促进机体对疫苗株感染做出免疫应答，对犬抵抗犬瘟热病毒的攻击可能起到积极的预防作用，由此显示PHA可以作为高效免疫增强剂与疫苗合用来提高疫苗的免疫效果。

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（2011–11–03）

云南省高端科技人才引进计划项目子项目，项目编号2009C11256，云南省教育基金项目

S853.76

A

1007-1733(2012)02-0005-03