牡蛎酶解产物改善小鼠学习记忆能力的初步研究

林海生，曹文红，卢虹玉，章超桦，吕妙兄，席 庆

(广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江 524088)

牡蛎酶解产物改善小鼠学习记忆能力的初步研究

林海生，曹文红，卢虹玉，章超桦*，吕妙兄，席 庆

(广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东湛江 524088)

探讨了牡蛎酶解产物对小鼠空间学习记忆能力的影响。选用中性蛋白酶、动物蛋白酶和复合酶分别水解牡蛎蛋白得到EHO1、EHO2和EHO3，分析其基本营养成分和分子量分布;采用Morris水迷宫行为学方法考察EHO对小鼠学习记忆的改善能力。结果显示，EHO含有丰富的肽、糖原、牛磺酸，分子量在主要集中在1300～10000u之间;定位航行测试显示，相对于空白组，EHO干预后小鼠的潜伏期都明显的缩短，空间搜索策略的比例明显提高，EHO3组效果最好，潜伏期(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空间搜索的比例为85.71%;而空间探索实验中，给药组小鼠的穿越次数、中央活动时间和目标象限路程比都有不同程度的增加。实验结果表明一定剂量的EHO能够提高小鼠的空间学习和记忆能力。

牡蛎酶解物，Morris水迷宫，学习记忆

近江牡蛎(Ostrea rivularis)又名海蛎子、蚝等，广泛分布在我国南北沿海，是我国主要经济贝之一。广东沿海对近江牡蛎的养殖历史悠久，资源十分丰富。牡蛎含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖原和微量元素等，营养价值极高，具有广泛的生理活性，素有“海洋牛奶”“根之源”之美名，已被我国卫生部批准为第一批既是药材又可作为食品保健品［1］。目前，国内牡蛎以鲜食为主，牡蛎加工比例仅占10%左右，加工品中以制成干肉制品为主，少量加工成蚝油或其它调味品［2］。随着牡蛎养殖业的快速发展，近江牡蛎的产量迅速增加，资源高值化利用及其深加工技术应用对于牡蛎产业的发展具有重要的意义。近些年研究发现牡蛎具有如抗癌、抗病毒、抗疲劳、抗氧化、降血糖、降血压、降血脂、醒酒护肝等多种生物活性［3］。学习和记忆是大脑高级神经功能之一，随着环境恶化和人口老龄化进程，导致学习记忆、认知功能衰退等中枢神经系统退行性疾病发病率逐年升高，如老年痴呆症 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森症(Parkinson’s disease，PD)等，其影响因子主要有神经肽及其他神经递质［4］。由于其发病成因多、机制复杂，单纯的西药治疗所取得的效果仍不尽人意，因而开发天然营养保健食品成为防治该类疾病的重要途径。目前已有报道牛磺酸［5］、微量元素［6］、中药活性成分［7］、猪脑水解物［8］、β－乳球蛋白肽［9］等物质具有改善增强记忆功能、延缓衰老和防治阿尔茨海默氏病的功能。本研究利用生物酶法制备牡蛎酶解物，采用Morris水迷宫实验考察牡蛎酶解物对小鼠空间学习和记忆功能的影响，为进一步深入研究牡蛎中增强学习记忆能力的活性成分及功能因子奠定前期基础，亦为开发相关保健食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎 购自广东省湛江市东风市场，经广东海洋大学蔡英亚教授鉴定为近江牡蛎 (Ostrea rivularis);昆明种小鼠 体重18～22g，雌雄对半，广东医学院实验动物中心提供，合格证书SYXK(粤)。

Morris水迷宫动物行为学分析系统 淮北生物仪器设备有限公司;HHS电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂;FJ－200组织匀浆器 上海标本模型厂;FDu－1100冷冻干燥机 TOKYO RIKAKIKAI; GL－10LMD高速冷冻离心机 湖南星科科学仪器有限公司;AUW 120分析天平 日本 SHIMADZU; LC－20AT型LPLC分析柱为蛋白凝胶柱PROTEINPAK 60(WAT085250) 日本岛津;LC－20AD型HPLC分析柱 hypersil ODS C18(120mm×4.0mm，5μm) 日本岛津;中性蛋白酶(20万μ/g)、木瓜蛋白酶(20万μ/g)、动物蛋白水解酶(20万μ/g) 广西庞博生物科技有限公司;其他试剂 分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎酶解产物的制备［1］工艺如下:新鲜牡蛎→清洗沥干→称重加水(m/V=1∶1)→组织均浆→酶解→灭酶(100℃，10min)→离心(6000r/min，15min)→上清液(测定水解度)→低温真空浓缩→冷冻干燥→浅黄色干粉，即牡蛎酶解产物(Enzymatic Hydrolysis of Oyster，以下简称EHO)。

酶解条件:pH7.0，时间3.0h，水解温度55℃，酶和底物比(E/S)2%，选用中性蛋白酶、动物蛋白酶、复合酶(中性蛋白酶、动物蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1∶1∶1)对牡蛎进行水解分别得到EHO1(中性蛋白酶酶解物)、EHO2(动物蛋白酶酶解物)和EHO3(复合酶酶解物)。

1.2.2 水解度的测定［10］总氮测定:凯氏定氮法; α－氨基态氮含量测定:甲醛滴定法。

水解度 DH(%)=(水解液中 α－氨基氮含量－水解前α－氨基氮含量)/(原料总氮含量－水解前α－氨基氮)×100

1.2.3 基本成分测定 水分测定:GB5009.3－2010直接干燥法;粗脂肪测定:GB5009.6－2003索氏抽提法;粗蛋白测定:GB5009.5－2010凯氏定氮法测定总氮含量再乘以6.25;灰分测定:GB5009.4－2010;总糖测定:硫酸苯酚法;总肽含量测定:双缩脲法［11］;牛磺酸含量测定:OPA柱前衍生高效液相色谱法［12］。

1.2.4 分子量分布测定 高效体积排阻色谱(HPSEC)法［13］。

1.2.5 动物分组及饲养 小鼠共40只，适养3d后称重，采用随机数字表法将其分成4组:EHO1组、EHO2组、EHO3组和空白组，按照相同灌胃剂量5g/(kg·d)分别灌以 EHO1、EHO2、EHO3和蒸馏水［1］。EHO分别配制成一定浓度的水溶液，每10g小鼠体重灌0.2m L。每天上午9:00～10:00灌胃一次，连续30d后进行Morris水迷宫定位航行实验，期间小鼠自由进食基础鼠粮及饮水。

1.2.6 Morris水迷宫实验［14－15］定位航行:Morris水迷宫为一直径1.2m、高0.5m圆桶，划为四个象限，有一直径10cm平台固定于某一象限，控制水的高度刚好没过平台，水温控制25℃。实验在当天灌胃30m in后进行，连续训练5d。先将小鼠放于水中平台30s熟悉周围环境，再分别将其从四个象限面向池壁放入水中，搜索时间设定为90s，其运动轨迹自动录像记录于电脑中，由MWM视频分析软件分析得出小鼠的游泳路径、找到站台时间(潜伏期:s)、平均游泳速度及搜索策略。

空间探索:用于测量动物对平台的空间位置的记忆能力。第6d撤掉平台，在相同入水点(离平台最远的象限)将鼠放入水中，搜索时间为90s，电脑录像自动记录小鼠的运动轨迹，通过MWM视频分析软件计算出各组小鼠的穿越平台次数、游泳总路程、中央活动时间和目标象限的路程比，综合评价小鼠记忆保持能力。

2 结果与讨论

2.1 EHO基本成分及分子量分布

中性蛋白酶、动物蛋白酶和复合酶酶解牡蛎蛋白的水解度(%)分别为14.95% ±0.80%、21.49% ± 2.73%和29.64%±3.32%。酶的水解能力具有专一性，不同的酶水解蛋白质的肽键不同。多酶复合可以增加酶对蛋白质分子的酶切位点，释放出更多的肽片段及游离氨基酸，从而提高蛋白的水解能力。高翔等［16］在酶解利用龙虾副产物中蛋白的研究中发现复合酶解效果优于单酶，不仅产品的水解效率提高，而且改善风味，减低苦味。在本研究中选用的动物蛋白酶属于多酶系，因此其水解度也大于中性蛋白酶。

基本成分测试结果显示(表1)，EHO的主要成分为蛋白质(肽)、糖原。三种牡蛎酶解物中粗蛋白含量接近，约占70%，但其中水溶性总肽含量却有所差别，EHO1＞EHO3＞EHO2;总糖和粗脂肪含量相差不远，分别约占14%和5%。同时含有丰富的牛磺酸，说明EHO具有很高营养价值和保健功能。

以分子量标准物质的保留时间(t)为横坐标，分子量的对数 LgMW 为纵坐标作图，得回归方程: LgMW=6.4972－0.2261 t，相关系数R=0.9877。图1为牡蛎蛋白酶解物EHO1、EHO2和EHO3的HPLC图，从图中可以看出，三个样品均含有5个主峰，但是相对于EHO1样品(tA=8.08m in)，EHO2和EHO3样品A峰(tA分别为8.55m in和8.58m in)较小且发生后移，其余4个峰的基本一致，可判断 EHO2和EHO3的水解程度较大，分子量相对较大的肽类物质比EHO1少。这结果与朱国萍等［13］在研究虾头自溶过程中发现随着水解度增大，酶解物的峰形不断向后推移的报道相一致，也与前面测得的总肽含量数据相吻合。根据回归方程计算出各峰处对应的相对分子质量，结果显示，EHO1、EHO2和EHO3的分子量分别集中于206～46807、200～36648、206～36042u之间，其中分子量在1300～10000u左右的低分子肽分别占57.76%、58.29%和61.83%。

表1 EHO主要营养成分含量(干粉)Table 1 Contents of themajor components in EHO

图1 EHO的分子量分布图Fig.1 Themolecular weight distribution of EHO

2.2 EHO改善小鼠空间学习记忆的功能

2.2.1 Morris定位航行 经过4d训练，小鼠寻找站台的时间明显缩短，说明重复性MWM训练可以提高小鼠的空间学习能力。最后一次定位航行实验结果显示，EHO1组和EHO3组小鼠的潜伏期(分别为(17.82±9.43)、(16.77±7.74)s)显著低于空白组(p＜0.05)，而EHO2组的潜伏期(20.85±3.77)s虽低于空白组，但没有显著差异(p＞0.05)，如图2所示。同时，相对于空白组，EHO3组小鼠的游泳速度显著降低(p＜0.01)，而EHO1和EHO2组则没有显著差异(p＞0.05)(图2)。潜伏期是衡量小鼠空间学习能力强弱的重要指标之一，而游泳速度是小鼠运动能力的重要指标，实验结果显示EHO3组小鼠学习能力与游泳速度有一定的相关性，这可能与小鼠的情绪和应激性有关，但游泳速度不能作为学习记忆能力强弱的直接指标［17］。

搜索策略是衡量动物分析判断能力和解决问题能力的重要指标，典型的四种搜索策略如图3所示(ABCD图)。学习和记忆过程中，小鼠的搜索策略随着训练次数的增加而呈现“边缘式→随机式→趋向式→直线式”的变化规律，学习记忆能力好的小鼠，其搜索策略以空间策略(趋向式和直线式)为主，相反则以边缘式和随机式为主［18］。搜索策略分析结果显示(图4)，与空白组相比，在EHO干预下的小鼠采用空间策略的比例均明显提高。其中以EHO3组最为明显，空间策略的比例占85.71%，而空白对照组仅占59%。采用直线式搜索策略比例最高亦为EHO3组，约占30%。

图2 定位航行实验中EHO对潜伏期和游泳速度的影响Fig.2 Effect of EHO on the escape latency and the swimming speed in navigation test

综上，在定位航行实验中，相对于空白组，EHO1组、EHO2组和EHO3组小鼠的潜伏期均有明显的缩短，而采取空间搜索的比例都有明显提高，其中EHO3组效果最好，潜伏期为(16.77±7.74)s，游泳速度为(14.61±3.71)cm/s，空间搜索的比例为85.71%。结果表明，EHO能够提高小鼠空间学习能力。

图3 典型的搜索策略和目标探索游泳路径图Fig.3 Representative pictures of the swimming trails in MWM

表2 EHO对小鼠空间记忆保持能力的影响Table 2 Effect of EHO on the ability of spatialmemory

图4 定位航行实验中小鼠空间搜索策略的分布Fig.4 Distribution of search strategies ofmice in place navigation test

2.2.2 Morris空间探索 空间探索测试结果显示: EHO1组、EHO2组和EHO3组小鼠穿越平台次数均高于空白组，相反，其游泳经过的总路程却均有所缩短，但没有显著性差异(p＞0.05);与空白组相比，EHO1组、EHO2组和EHO3组小鼠在中央活动时间均有显著性增加(p＜0.05)，EHO2组的时间最长为(61.04±3.44)s(p＜0.05);同时EHO2组的目标象限路程比为(28.192±2.99)%(p＜0.05)，显著高于空白组，而EHO1组和EHO3组该指标没有显著性差异(p＞0.05)(表2)。EHO2和空白组的游泳路径如图4(E图和F图)。

小鼠穿越平台次数是衡量小鼠对平台空间位置学习记忆能力的重要指标［19］。任建华等［20］评价小米和大豆为基料的婴幼儿辅食改善小鼠记忆作用采用穿越平台次数做指标。而王维刚等人［21］在研究MWM实验方法中结合游泳总路程、中央活动时间、目标象限路程比等其他指标进行综合评价。从表2数据看出，EHO干预后小鼠的穿越平台次数、中央活动时间及目标象限路程比有不同程度的升高，行为学指标表明EHO能够提高小鼠空间学习记忆的保持能力，其中以EHO2组效果最好。

综上所述，EHO能够提高实验小鼠的空间学习和记忆能力。

3 结论

牡蛎具有丰富营养价值和广泛的生物活性，利用酶解技术是牡蛎资源精深加工的重要途径。牡蛎蛋白酶解物含有丰富的营养物质和活性因子，如肽、糖原、牛磺酸等，分子量在主要集中在1300～10000u之间。Morris水迷宫实验结果显示，相对于空白组，EHO干预后小鼠的潜伏期均有明显的缩短，而采取空间搜索的比例都有明显提高，其中EHO3组最为显著，潜伏期为(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空间搜索的比例为85.71%;而空间探索实验中，给药组小鼠的穿越次数、中央活动时间和目标象限时间比都有所增加，以EHO2组效果最好，穿越次数3.14±0.9，中央活动时间为(61.04±3.44)s(p＜0.05)，目标象限路程比为(28.19±2.99)%(p＜0.05)。实验结果表明一定剂量的EHO能够提高小鼠的空间学习和记忆能力。由于酶解产物成分较复杂，其改善小鼠空间学习记忆功能的主要因子和作用机理有待于进一步研究。

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Prelim inary research on the function of enzymatic hydrolysis of oyster to im prove the learning and memory in m ice

LIN Hai－sheng，CAO W en－hong，LU Hong－yu，ZHANG Chao－hua*，LV M iao－xiong，XIQing
(Food Science and Technology Institute of Guangdong Ocean University，Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China)

Investigation of the effec t of enzymatic hyd rolysis of oyster(EHO)on learning and memory ab ility.The contents ofmajor components and the molecular weight distribution of the EHO p repared respectively by adding neutrase，p roteolytic enzymes and m ixed enzymes were test，then the learning and memory ability were assessed using the Morris watermaze(MWM)w ith one controlgroup.The results showed that the EHO was rich in pep tide，glycogen and taurine，and the molecularweights were from 1300～10000u.MWM test indicated that the p roportion of spatial strategy of the treated g roups were higher and the escape latency were significantly shorter com pared to the control g roup.EHO3 group was the best one，the escape latency was(16.77±7.74)s(p＜0.05)and the p roportion of spatialstrategy reached 85.71%.All the three EHO g roups had more number of c rossings，longer time in the center and longer d istance in the target quad rant than that of control g roup in the spatial p robe test.These find ings suggested that certain amount of EHO could im p rove the learning and mem ory ab ility ofm ice.

enzym atic hyd rolysis of oyster;Morris waterm aze;learning and memory

TS218

A

1002－0306(2012)19－0341－05

2012－02－27 *通讯联系人

林海生(1985－)，男，在读研究生，研究方向:海洋生物资源利用。

国家现代农业产业技术体系(CARS－48)。