海参磷脂型二十碳五烯酸对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏功能改善作用的研究

刘月娇，徐雷雷，柳 东，李 冰，李 辉，张 珣，王静凤

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

海参磷脂型二十碳五烯酸对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏功能改善作用的研究

刘月娇，徐雷雷，柳 东，李 冰，李 辉，张 珣，王静凤*

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

目的:研究海参磷脂型二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine，EPA－PC)对链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏功能的改善作用。方法:通过腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，经不同剂量海参EPA－PC(25和75mg/kg，以EPA含量计)灌胃8w。实验结束后，分别检测大鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量、肾脏指数、24h尿量、血清尿素氮(BUN)、尿总蛋白、白蛋白(mAlb)、尿酸(UA)含量及β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)活性。结果:海参EPA－PC可显著改善糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量(p＜0.05)，降低糖尿病大鼠的肾脏指数(p＜0.01)、24h尿量、血清BUN、尿总蛋白、mAlb、UA含量及NAG活性(p＜0.01)。结论:海参EPA－PC对糖尿病大鼠的肾脏功能具有较好的改善作用。

多不饱和脂肪酸，海参EPA－PC，糖尿病肾病，血糖，尿白蛋白，肾脏保护

糖尿病肾病(diabetic nephropathy)是糖尿病慢性并发症之一，以血管损伤的肾小球病变为主，并伴有尿蛋白，肾功能衰退等症状，成为糖尿病患者死亡的主要原因之一。二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)是海洋鱼类中含量较为丰富的ω－3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，与人体的生理功能密切相关［1－2］。研究发现［3］，EPA可维持大脑、视网膜等的正常功能和生长发育，具有抑制血小板凝聚、调血脂、抗血栓、抑制炎症、提高机体免疫力等功效。张敏芳等研究发现［4］，EPA具有改善患糖尿病小鼠的肾组织病变的作用。EPA－PC是一种EPA和磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)Sn－2位相结合形成的化合物，和单纯的EPA相比，海参EPA－PC具有较高的生物利用率、抗氧化性以及易于被小肠吸收的特性［5］。本实验以海参EPA－PC为研究对象，观察其对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏的改善作用，以进一步挖掘海参 EPA－PC的生物利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干冰岛刺参 购于青岛市水产品市场;健康SD雄性大鼠 体重(200±20)g，SPF级，北京维通利华动物实验技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2007－0001;链尿佐菌素(Streptozotocin，STZ) Sigma;葡萄糖测定试剂盒 北京中生北控生物科技股份有限公司;血清尿素氮、尿酸、β－N乙酰葡萄糖苷酶测定试剂盒 南京建成科技有限公司;尿微量白蛋白测试盒(免疫比浊法) 上海太阳生物技术公司;TGL－16G型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;680型酶标仪 美国Bio－Rad。

1.2 实验方法

1.2.1 海参EPA－PC的制备 取干冰岛刺参，粉碎成粉末，加水浸泡24h，去水，加入甲醇、氯仿浸提24h。过滤得滤液，在滤液中加入适量的蒸馏水并充分搅拌，静置分层后收集下层有机溶剂层，Na2SO4·5H2O干燥后低温旋转蒸发，得到黏稠脂质样品。经丙酮、甲醇清洗除杂，即得到EPA含量较高的脂质样品［6］。经高效液相色谱法［7］测得PC含量为72%，气相色谱法［7］测得脂肪酸组成中EPA含量为30%。将EPA－PC与等摩尔胆固醇混合，用少量氯仿溶于茄形瓶中，冲入氮气保护，旋蒸成均匀薄层，生理盐水震荡混匀，冲入氮气后低温超声溶解成水溶性悬浊液，即为实验用海参EPA－PC。

1.2.2 模型建立和动物实验 随机选取10只健康SD大鼠作为正常对照组。其余所有大鼠禁食不禁水12h，于当日和次日分别以45、10mg/kg的剂量两次腹腔注射STZ(溶解于pH4.4的0.1mol/L柠檬酸－柠檬酸纳缓冲液)，正常对照组大鼠注射等体积柠檬酸－柠檬酸纳缓冲液。饲养72h后，对造模大鼠禁食不禁水5h，尾静脉采血测空腹血糖值，以血糖值≥16.7mmol/L者作为成功糖尿病模型。

将造模成功的大鼠按体质量和血糖值随机分为糖尿病模型对照组、海参EPA－PC低、高剂量组(25、75mg/kg·bw，以EPA含量计)，每组10只。分组当日开始灌胃海参EPA－PC，正常组和模型组灌胃生理盐水，灌胃体积为10m L/kg，每天一次，连续8w。实验期间，大鼠自由进食和饮水。于末次给药后，大鼠代谢笼单只收集24h尿液，离心，取上清液分装，4℃保存待测。于末次给药后，大鼠禁食10h，乙醚麻醉，腹主动脉取血、处死。摘取双肾，称重。收集血液、分离血清，用于生化指标的测定。

1.2.3 血糖的测定 于末次给药后，大鼠禁食不禁水5h，尾静脉取血20μL加入到0.4m L蛋白沉淀剂中，混匀，在室温下静置7m in，离心，取上清液，参照试剂盒法测定空腹血糖值。

1.2.4 葡萄糖耐量的测定 于末次给药后，大鼠禁食不禁水5h，以2g/kg的剂量空腹灌胃葡萄糖溶液。分别于灌胃后的0、0.5、2h经尾静脉取血，测定各时刻的血糖值，并按公式计算曲线下面积(area under the curve，AUC):AUC(h·mmol/L)=1/2×(A+B) ×0.5+1/2×(B+C)×1.5。其中，A、B、C分别为0、0.5、2 h的血糖值。

1.2.5 肾脏指数 肾脏肥大指数=［双侧肾脏重量之和(g)/体重(g)］×100。

1.2.6 血清尿素氮排出量的测定 参照试剂盒方法测定。

1.2.7 尿中总蛋白、白蛋白排出量的测定 总蛋白采用双缩脲试剂法测定，白蛋白排出量参照试剂盒方法检测。

1.2.8 尿酸(UA)排出量和 β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)排泄率的测定 参照试剂盒方法测定。

1.2.9 统计学处理 采用SPSS11.0软件处理数据，进行单因素方差分析，同时进行LSD比较，以p＜0.05作为具有统计学意义上的差异，实验结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 对空腹血糖量及葡萄糖耐量的影响

如表1所示，模型对照组大鼠空腹血糖浓度以及葡萄糖耐量和正常组相比显著升高，具有统计学意义(p＜0.01)。灌胃海参EPA－PC后，剂量组大鼠空腹血糖值和糖耐量均下降。和正常组相比，模型组大鼠空腹血糖浓度以及葡萄糖耐量显著升高，具有统计学意义(p＜0.01)。其中和模型组相比高剂量组的口服葡萄糖耐量降低了14.4%，得到明显的改善(p＜0.05)。说明海参EPA－PC对糖尿病大鼠具有较好的降血糖作用。

表1 海参EPA－PC对糖尿病大鼠空腹血糖量、AUC及肾脏指数的影响(n=10，±s)Table 1 Effect of EPA－PC on plasma glucose，AUC and kidney indice in diabetic rats(n=10，±s)

表1 海参EPA－PC对糖尿病大鼠空腹血糖量、AUC及肾脏指数的影响(n=10，±s)Table 1 Effect of EPA－PC on plasma glucose，AUC and kidney indice in diabetic rats(n=10，±s)

注∶##p＜0.01与正常组相比较;*p＜0.05、＊＊p＜0.01与模型组相比较，表2同。

组别 空腹血糖值(mmol/L) AUC (h·mmol/L)肾脏指数(g/kg) 5.99±0.75 14.23±1.22 0.61±0.02模型对照组 23.28±2.84## 49.57±2.70## 1.2±0.09##低剂量组 23.26±4.87 45.56±3.46 1.19±0.15高剂量组 21.78±4.52 42.42±3.01* 1.07±0.06正常对照组＊＊

2.2 对肾脏指数的影响

如表1所示，模型对照组大鼠肾脏指数较正常组相比升高了96.721%(p＜0.01)。灌胃海参EPAPC后，剂量组大鼠肾脏指数明显降低。其中，高剂量组大鼠较模型组下降了10.83%(p＜0.01)，说明海参EPA－PC对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏肥大具有一定的改善作用。

2.3 对血清BUN含量的影响

血清BUN是蛋白质分解产物，在人体内经肾小球过滤随尿液流出体外。因此，血清BUN的含量可作为评价肾功能的标志物。如表2所示，灌胃海参EPA－PC后，剂量组大鼠血清BUN含量下降。与模型对照组相比，低、高剂量组大鼠血清BUN分别下降了34.65%、44.59%(p＜0.01)。

2.4 对尿中总蛋白、白蛋白排出量的影响

尿蛋白及白蛋白排出量增多是肾脏病变的早期表现之一［8］。如表2所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠的尿蛋白和白蛋白排出量显著升高(p＜0.01)。灌胃海参EPA－PC后，剂量组大鼠尿中总蛋白、白蛋白排出量均降低。与模型对照组相比，低、高剂量组大鼠尿中总蛋白排出量分别降低了30.72%和47.89%(p＜0.01)，白蛋白排出量分别降低了 17.35% 和 46.94%(p＜0.01)，说明海参EPA－PC对糖尿病肾病大鼠的肾脏病变具有显著改善作用。

表2 海参EPA－PC对糖尿病大鼠24h排尿量、总蛋白、mAlb、BUN、UA排出量及NAG活性的影响(±s，n=10) Table 2 Effect of EPA－PC on the 24h urine volume，the excretion of protein，the levels ofmAlb in urine，BUN in plasma，UA and NAG in urine in diabetic rats(n=10，±s)

表2 海参EPA－PC对糖尿病大鼠24h排尿量、总蛋白、mAlb、BUN、UA排出量及NAG活性的影响(±s，n=10) Table 2 Effect of EPA－PC on the 24h urine volume，the excretion of protein，the levels ofmAlb in urine，BUN in plasma，UA and NAG in urine in diabetic rats(n=10，±s)

组别 24h排尿量(mL)总蛋白排出量(mg/L) mAlb排出量(mg/L) BUN排出量(mmol/L) UA排出量(mg/L) NAG活性(U)正常对照组 11.25±5.49 1.49±0.18 0.43±0.02 12.42±0.36 3.77±0.19 0.52±0.06模型对照组 133.83±19.86## 3.32±0.29## 0.98±0.11## 48.46±8.02## 16.36±2.53## 1.36±0.31##低剂量组 71.00±36.37＊＊ 2.30±0.22＊＊ 0.81±0.08 31.67±16.68＊＊ 11.94±4.11* 0.91±0.22*高剂量组 37.33±10.04＊＊ 1.73±0.18＊＊ 0.52.±0.14＊＊ 26.85±8.42＊＊ 6.47±2.21＊＊ 0.66±0.17＊＊

2.5 对24h尿量和尿酸(UA)排出量的影响

尿量增多可视为糖尿病的一个重要症状。如表2所示，模型对照组大鼠24h尿量显著增加(p＜0.01)，灌胃海参EPA－PC后，剂量组大鼠24h尿量降低。低、高剂量组较模型组大鼠24h尿量分别降低了46.95%和72.11%(p＜0.01)，说明海参EPA－PC对改善大鼠多尿症状有显著效果。

如表2所示，模型组大鼠与正常组相比，UA排出量显著升高(p＜0.01)，灌胃海参EPA－PC后，剂量组大鼠UA排出量降低。低、高剂量组较模型组大鼠UA排出量分别降低了27.02%和60.45%(p＜0.05，p＜0.01)，说明海参EPA－PC可以有效的改善肾小球滤过功能，降低体内蛋白质、核酸等的分解，对体内代谢循环起到调节的作用。

2.6 对尿液β－N乙酰葡萄糖苷酶(NAG)活性的影响

NAG是一种溶酶体酶，当肾实质性病变及蛋白质自肾小球滤过后排出量升高时，将引起尿中NAG活性增加。因此，NAG活性增高可作为糖尿病肾病的早期诊断［9］。如表2所示，模型组大鼠与正常组相比，NAG活性显著升高(p＜0.01)。低、高剂量组较模型组大鼠NAG活性分别降低了33.09%和51.47% (p＜0.05，p＜0.01)，说明海参EPA－PC对肾小球有一定的保护作用。

3 讨论与结论

糖尿病肾病是糖尿病中的一种慢性微血管并发症，发病的主要特征为血糖浓度升高，葡萄糖耐量减退，肾小球肥大，出现尿蛋白和肾功能受损等现象［10］。本实验利用STZ诱导SD大鼠，导致实验大鼠血糖值升高而建立糖尿病模型，探讨了海参EPA－PC对糖尿病大鼠的肾脏改善作用。结果表明，糖尿病大鼠喂食海参EPA－PC后，其高血糖、多尿及肾小球滤过作用下降等症状得到显著改善，提示海参EPAPC具有改善肾脏功能的显著作用。

高血糖使肾小球灌注率和滤过率增加，造成肾小球滤过膜受损，因而控制空腹血糖值和葡萄糖耐量在改善糖尿病肾病的肾脏功能上至关重要［11］。实验结果显示，喂食海参EPA－PC的糖尿病肾病大鼠的糖耐量有良好的改善。张敏芳发现［12］，EPA对糖耐量情况的改善有利于减轻糖尿病肾病的炎症和氧化应激状态，控制糖尿病病情。这与本文的研究结果一致，说明海参EPA－PC能显著改善糖尿病大鼠高血糖症状，调节肾脏功能。糖尿病肾病损伤肾小球毛细血管，造成血清BUN含量及尿中总蛋白、白蛋白排出量增高。有报道显示，糖尿病肾病引发肾小球毛细血管基底膜增厚，导致肾小球发生硬化，使蛋白滤过量超过肾小管的重吸收量，从而引起尿中蛋白含量的升高［13］。由于糖尿病导致肾小管对葡萄糖的重吸收增加而竞争性抑制了对UA的重吸收，使UA排泄增加［14］。当肾小管受损时，存在于肾近曲小管上皮细胞溶酶体中的NAG不能由正常的肾小球滤过作用而滤出，引起尿中NAG升高［7］。本实验研究结果显示海参EPA－PC可以显著改善糖尿病大鼠体内的BUN，以及尿中总蛋白、mAlb、UA及NAG的排出量。结果提示海参EPA－PC可以降低肾小球和肾小管的受损程度，提高其滤过功能，从而改善糖尿病肾病大鼠的肾脏功能。

有研究报道称，EPA能够减轻糖尿病肾病大鼠肾小球系膜基质的积聚和间质纤维化程度，对肾组织病变具有改善作用［4］，而且能够使高糖诱导的炎症因子表达明显降低，减轻肾脏炎症反应［15］。提示海参EPA－PC可能是通过改善糖尿肾病大鼠病变的肾组织结构，降低炎症基因的表达从而对肾脏起到的保护作用，具体的作用机制尚在进一步研究中。

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Protection of EPA－PC liposome on kidney of diabetic rats induced by STZ

LIU Yue－jiao，XU Lei－lei，LIU Dong，LIBing，LIHui，ZHANG Xun，WANG Jing－feng*
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

Ob jective:To study the p rotective effects of Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine(EPA－PC)on kidney of d iabetic rats induced by Strep tozocin(STZ).Methods:Diabetes mellitus induced by STZ were adm inistered by d ifferent dosages of EPA－PC(25 mg/kg，75 mg/kg)by stomach perfusion，for8 weeks.At the end of the experiment，the ind ices inc lud ing the changes of the levels of fasting b lood g lucose，Oralg lucose tolerance，the renal index，the 24h urine volume，the levels of BUN in p lasma，the excretion of p rotein，m Alb，BUN，UA and NAG in urine were determ ined.Results:The EPA－PC showed remarkab le hypog lycem ic effected on Oral g lucose tolerance of d iabetic rats(p＜0.05)，and decreased the renal p rotein，m Alb，UA and NAG in urine had reduced significantly(p＜0.01).Conc lusion:EPA－PC can effec tively im p rove the kidney func tion in d iabetic rats.

ω－3 polyunsaturated fatty acids;Eicosapentaenoic Acid Phosphatidylcholine;d iabetic nephropathy; b lood－g lucose;m Alb;p rotec tion of kidney

R965

A

1002－0306(2012)19－0331－04

2012－02－27 *通讯联系人

刘月娇(1990－)，女，本科，研究方向:海洋生物活性。

国家自然基金资助项目(30972284);海洋公益性行业科研专项资金资助项目(201105029);国际科技合作项目(2010DFA31330);浙江省重大科技专项(2008C02009);泰山学者建设工程专项经费。