榆黄蘑可溶性蛋白的提取及其对羟自由基的清除作用

杨芳， 吕玲玲， 施溯筠

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

YANG Fang， LU Ling－ling， SHI Su－yun＊

（Key Laboratory for Natural Resource of Changbai Mountain ＆Functional Molecules（Yanbian University），Ministry of Education，Yanji 133002，China）

榆黄蘑可溶性蛋白的提取及其对羟自由基的清除作用

杨芳， 吕玲玲， 施溯筠＊

（延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林 延吉133002）

对榆黄蘑可溶性蛋白的提取工艺进行了研究．首先以蒸馏水、HCl、NaCl、NaOH和磷酸缓冲液等为溶剂，考察了不同提取液对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响；然后通过单因素实验分别探讨了提取液浓度、提取时间、料液比和提取温度对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响，并采用正交实验组合设计进一步确定了榆黄蘑可溶性蛋白的最佳提取条件：提取液NaOH的浓度为0．075 mol/L，料液比为1∶40，提取温度为50℃，提取时间为2 h，在此条件下的提取率为28．14 g/100 g（榆黄蘑粉）．最后采用邻二氮菲－Fe氧化法测定了榆黄蘑可溶性蛋白对羟自由基的清除作用，发现榆黄蘑可溶性蛋白对羟自由基有较好的清除作用．

榆黄蘑；可溶性蛋白；提取；羟自由基

0 引言

榆黄蘑（Pleurotus citrinopileatus Sing）是一种可食用菌，属担子菌亚门，伞菌目，侧耳科，侧耳属，是长白山著名的药食两用真菌［1］．研究表明［2］，榆黄蘑干燥子实体富含多种氨基酸和微量元素，并有丰富的人体所必需的蛋白质和氨基酸，其中蛋白质含量高达41．5%．刘晓峰等人［3］从榆黄蘑中分离出尿嘧啶、β－吡啶甲酸、D－甘露醇、延胡索酸、油酸、麦角甾醇等活性成分．文献［4－7］研究表明，榆黄蘑的多糖具有抗肿瘤、抗遗传毒性、降脂、降血糖、提高免疫力的活性成分．Anthiny等［8］研究发现，大豆蛋白具有降低胆固醇含量、预防心血管疾病、缓解骨质疏松症和改善更年期症状等作用．易翠平等［9］研究发现，大米蛋白含有丰富的赖氨酸，必需氨基酸含量接近FAO/WHO建议模式（1973），是禾谷类粮食中最好的一种蛋白质．Fujita等［10］分离出一种鲣鱼多肽（含LLPNM序列），其对高血压患者具有降血压作用，且无副作用．Cui等［11］从榆黄蘑的新鲜子实体提取液中分离纯化出一种碱性蛋白酶，其在K2＋和Li2＋离子中具有较高的活性，但其活性受到Al3＋、Cu2＋、Hg2＋离子的抑制．本文采用超声提取榆黄蘑中蛋白质，通过单因素和正交实验探讨提取液、提取液浓度、提取时间、料液比和提取温度对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响，并研究榆黄蘑可溶性蛋白对羟自由基的清除作用，为榆黄蘑产品的开发提供实验依据．

1 试药与仪器

邻二氮菲和牛血清蛋白购自Sigma公司，考马斯亮蓝、NaOH、K2HPO4·3 H2O、KH2PO4、NaCl、浓盐酸等皆为分析纯．榆黄蘑购买于吉林省延吉市西市场，经60℃干燥48 h后粉碎，过60目筛，得榆黄蘑粉．仪器有：U－1900紫外分光光度计（Hitachi High－Technologies Corporation，Japan）；FDU－2200冷冻干燥机（Tokyo Rikakikai CO．，Ltd．，Japan）；DHG－9146A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）．

2 方法与结果

2．1 蛋白含量的测定

蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G－250法，用标准牛血清蛋白做标准品，于595 nm处检测吸光度值，Y＝11．468 X＋0．000 9，相关系数R2＝0．999 1．

2．2 不同提取溶剂对蛋白提取率的影响

称取2 g榆黄蘑粉5份，分别以蒸馏水、HCl（0．05 mol/L，p H＝2．5）、磷酸缓冲液（PBS，0．2 mol/L，p H＝8．0）、NaOH（0．1 mol/L）、NaCl（0．5 mol/L）等为溶剂，超声提取5 min（功率为100 Hz）；于50℃下浸提7 h（料液比为1∶30），所得产物过滤除去沉渣，然后用考马斯亮蓝法测上清液中的蛋白含量．由图1可知，各提取溶剂的提取效果依次为Na OH＞HCl＞PBS＞水＞NaCl．碱液的提取效果最佳表明榆黄蘑中酸性蛋白最多．

图1 不同提取溶剂对榆黄蘑可溶性蛋白提取的效果

2．3 单因素试验

2．3．1 碱液浓度对蛋白提取率的影响 称取2 g榆黄蘑粉5份，分别加入不同浓度的NaOH溶液80 m L（0．012 5、0．025、0．05、0．075、0．1、0．125、0．15 mol/L），混匀后超声5 min；于50℃ 浸提6 h，产物过滤后取上清液测定蛋白含量．由图2可知，NaOH的浓度对提取率的影响较大，当NaOH的浓度为0．05 mol/L时，榆黄蘑蛋白的提取率达到16．24%，随着Na OH浓度的增加，提取率没有明显增加，所以NaOH的浓度选择为0．05 mol/L．

图2 不同浓度的NaOH对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响

2．3．2 提取时间对蛋白提取率的影响 称取2 g榆黄蘑粉5份，分别加入80 m L（0．05 mol/L）NaOH溶液，混匀后超声5 min；于50℃分别浸提0．5、1、2、3、4、5 h，产物过滤后取上清液测定蛋白含量．由图3可知，提取3 h的蛋白提取率最高．

图3 提取时间对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响

2．3．3 料液比对蛋白提取率的影响 称取2 g榆黄蘑粉5份，分别加入0．05 mol/L NaOH溶液20、40、60、80、100 m L，混匀后超声5 min；于50℃浸提2 h，产物过滤后取上清液测定蛋白含量．由图4可知，当料液比为1∶40时蛋白提取率最高．

图4 料液比对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响

2．3．4 提取温度对蛋白提取率的影响 称取2 g榆黄蘑粉，加入80 m L（0．05 mol/L）NaOH溶液，混匀后超声5 min；分别于30、40、50、60、70℃水浴提取3 h，产物过滤后取上清液测定蛋白含量．由图5可知，提取温度对提取效果的影响较大，提取温度为60℃时提取率最高．鉴于蛋白质的热不稳定性以及工艺成本，且50℃时的提取率也相对较高，故最适温度选择为50℃．

图5 提取温度对榆黄蘑可溶性蛋白提取率的影响

2．4 正交实验

采用正交表L9（34）做正交试验，通过组合设计考察了提取体系中提取温度、料液比、碱液浓度以及提取时间对榆黄蘑中蛋白提取率的影响，并以此确定最佳的提取工艺条件，详见表1．

表1 正交实验因素水平

由表2可知，除提取时间外，提取温度、碱液浓度和料液比都对蛋白的提取率有较大的影响．4个因素对榆黄蘑蛋白提取的影响程度为A＞C＞B＞D．由极差分析可知，A2B2C3D1为最佳组合，即在提取时间为2 h、提取温度为50℃、料液比为1∶40、NaOH的浓度为0．075 mol/L的条件下，可溶性蛋白的提取率为28．14 g/100 g．

表2 提取榆黄蘑中蛋白的L9（34）正交试验

2．5 清除羟自由基的测定

按照2．4中的最佳方法提取榆黄蘑可溶性蛋白，并用冷冻干燥法将其制备成干粉．用0．075 mol/L的NaOH溶液分别将干粉制成1、2、3、4、5、6 mg/m L的溶液，并以Vc为对照，采用邻二氮菲－Fe氧化法［12］测定其对羟自由基的清除作用．由图6可知，榆黄蘑的可溶性蛋白对羟自由基具有较好的清除作用，且随着蛋白质量浓度的增加其效果更加明显，蛋白浓度为6 mg/m L时，对羟自由基的清除率达94．5%，接近Vc（相近浓度）的清除水平．

图6 不同浓度的榆黄蘑可溶性蛋白对羟自由基的清除作用

3 结论

不同材料的蛋白其提取方法也不同，一般水溶性蛋白的提取采用水提、稀酸、稀碱、稀盐、缓冲液等．影响蛋白质提取率的因素有很多，如温度、溶液的p H值、提取时间、料液比、离子强度等．本实验选择了溶剂浓度、提取温度、料液比和提取时间来研究其对榆黄磨蛋白提取率的影响．结果显示：榆黄蘑可溶性蛋白的最佳提取条件为A2B2C3D1，即提取时间为2 h，提取温度为50℃，料液比为1∶40，NaOH浓度为0．075 mol/L．由于榆黄蘑属真菌类，考虑其细胞壁对蛋白溶出的影响，本实验选择了超声破壁和涡旋混匀的辅助手段来提高了提取效率．

另外，本文的前期实验表明，榆黄蘑具有较强的抗氧化性，且鲜品比干品的抗氧化性更高，这可能是因为一些抗氧化物质在干燥过程中丧失了活性，如蛋白质等［13］．本实验证实了榆黄蘑可溶性蛋白具有较强的清除羟自由基的作用，其功能有待进一步研究．

［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草：第1册［M］．上海：上海科学技术出版社，1999：578．

［2］ 郭娟，赵晶，孙佳明，等．超滤对榆黄蘑中多糖含量和蛋白含量的影响［J］．中国民族医药杂志，2010，16（6）：37－40．

［3］ 刘晓峰，李玉，孙晓波，等．榆黄蘑（Pleurotus citrinopileatus）化学成分和药用活性的研究［J］．吉林农业大学学报，1998，20（增刊）：181．

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Extracting technology of soluble protein of Pleurotus citrinopileatus and its antioxidant activities on hydroxyl radicals

Extracting technology of soluble protein of Pleurotus citrinopileatus are resarch on different solution of distilled water，HCl，NaCl，NaOH and phosphate buffer solution．And that study the single factor experiment and the orthogonal experimental design on extraction solution concentration，time，ratio of material to liquid，extraction time and temperature．The results show that the optimum extraction process are extraction time 2 h，extraction temperature of 50℃，solid－liquid ratio 1∶40，NaOH concentration of 0．075 mol/L，and under this condition soluble protein extraction rate is 28．14 g/100 g（Pleurotus citrinopileatus powder）．Further，we discovere the Pleurotus citrinopileatus soluble protein have better removal effect on·OH．

Pleurotus citrinopileatus；soluble protein；extraction；·OH

R285．5；S646．9；TS201．2

A

1004－4353（2012）02－0142－04

YANG Fang， LU Ling－ling， SHI Su－yun＊

（Key Laboratory for Natural Resource of Changbai Mountain ＆Functional Molecules（Yanbian University），Ministry of Education，Yanji 133002，China）

2012－02－15

＊通信作者：施溯筠（1972—），女，博士，副教授，研究方向为天然生物资源的开发与活性成分研究．