白藜芦醇对大鼠脊髓损伤后氧化与抗氧化过程的影响

梅红军 刘洋 郑先念 张觅 王河忠

脊髓损伤﹙SpinalCord Injury,SCI﹚的病理作用可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤所造成的神经损害是永久性的，功能无法恢复。继发性损伤具有可逆性和可调控性，使脊髓损伤具有可恢复性[1]。近几年报道认为细胞凋亡也是脊髓损伤机制中十分重要的因素之一[2]。目前有关药物治疗脊髓损伤的研究相当多[3]，但主要限于实验阶段，能够用于临床的药物非常少，如甲基强的松龙等。现在有关白藜芦醇在脊髓损伤中的作用已有报道，但是研究仍然不够完善。

本实验组通过口服方法研究白藜芦醇在脊髓损伤后脊髓组织氧化和抗氧化过程的作用，探讨白藜芦醇对脊髓损伤后神经细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

髓过氧化物酶﹙MPO﹚检测试剂盒和超氧化物歧化酶﹙SOD﹚检测试剂盒由南京某生物公司提供。白藜芦醇购自南京某医药有限公司，纯度98%以上；MPSS由浙江某药股份有限公司生产。在武汉大学人民医院实验中心选用SPF级雄性SD大鼠96只，体重250±50g。

1.2 实验方法

本实验采取随机区组设计，实验样本随机分为 4大组，即假手术组、损伤组、RES组、MPSS﹙阳性对照﹚组；每组24只，每组据损伤后处死时间﹙8小时、1天、3天、7天﹚随机分为4个小组，每个小组6只。据Allen’s法人工造成中度脊髓损伤模型，药物组术后立即按100mg/kg管饲MPSS或白藜芦醇。取出以T8为中心新鲜脊髓组织，制成10%脊髓组织匀浆液，提取上清液，-20℃冰柜保存，以备酶活性检测。

1.3 结果测定

将各组脊髓组织匀浆液上清夜利用试剂盒进行检测，以比色法测定脊髓神经组织细胞MPO和SOD活性，以表示。

1.4 统计学处理

采用 SPSS 11.5版统计软件进行单向方差分析﹙One way-Anova，先进行方差齐性检验，再进行方差分析，然后采用S-N-K法进行样本均数间的多重比较﹚，有统计学差异的位于不同列，没有统计学差异的位于同一列。

2 结果

2.1 髓过氧化物酶﹙MPO﹚活性

由表1可见脊髓损伤后MPO活性明显升高，3天达到高峰，其后逐渐减弱，7天活性明显减弱，白藜芦醇组及MPSS组均能降低各时间点的MPO活性，抑制MPO升高幅度，差异具有极度显著性统计学意义﹙＜ 0.01﹚；脊髓损伤后8小时白藜芦醇组与 MPSS组具有极度显著性统计学差异性﹙＜0.01﹚，脊髓损伤后1天白藜芦醇组与MPSS组具有显著性统计学差异性﹙＜ 0.05﹚，但是3天及7天两者并无显著差异性﹙＞0.05﹚，这显示白藜芦醇组的疗效存在优于MPSS组的趋势。

表1 髓过氧化物酶﹙MPO﹚活性﹙,n=6,U/mg prot﹚

表1 髓过氧化物酶﹙MPO﹚活性﹙,n=6,U/mg prot﹚

与假手术组比较a＜0.01；与损伤组比较，b＜ 0.01；c＜0.05；与RES组比较d＜ 0.01；e＜0.05。

表2 超氧化物歧化酶﹙SOD﹚活性﹙,n=6,U/ml· mg﹚

表2 超氧化物歧化酶﹙SOD﹚活性﹙,n=6,U/ml· mg﹚

与假手术组比较，a：P ＜ 0.05；与损伤组比较，b：P ＜ 0.05；c：P ＜ 0.01；与 RES 组比较，d：P ＜ 0.05。

由表2可见在脊髓损伤后8小时、1天、3天及7天白藜芦醇组及MPSS组与损伤组间差异均有显著意义，但脊髓损伤后8小时、3天及7天白藜芦醇组与MPSS组间差异无显著性意义﹙>0.05﹚，这表明脊髓损伤后8小时、1天、3天及7天白藜芦醇与MPSS均可以提高损伤脊髓的SOD活性，8小时、3天及7天两者的作用效果具有相似性，但是在损伤后1天两者显示出明显差异性，而且损伤后8小时、3天及7天白藜芦醇组的作用效果要强于甲基强的松龙组，这表明白藜芦醇与MPSS的作用机制存在一定的差异性。

3 讨论

白藜芦醇是从天然植物中分离出的活性单体，有一系列的衍生物，广泛存在于葡萄属种子植物之中[4]。1940年 Takaoka从毛叶藜芦中分离出白藜芦醇，化学名为3，5，4’-三羟基苯二烯，属多酚类化合物。白藜芦醇的生物学作用主要包括：拮抗肿瘤作用、抗炎作用、心血管保护作用、植物雌激素作用和影响骨钙代谢等，而且具有神经保护作用[5]。

白藜芦醇口服后在肠道以葡萄糖醛酸酯形式易于吸收，半吸收时间为0.46小时，人口服白藜芦醇1.5mg/kg,30分钟血中达高峰，120分钟恢复；大鼠口服60分钟达高峰，240分钟消失[3]。

脊髓继发性损伤的病理生理机制非常复杂，许多学者提出了各种各样的假说。李俊丽[6]总结有关理论主要有：①创伤后缺血性损伤；②炎症损伤；③钙内流超载损伤；④自由基损伤；⑤兴奋性氨基酸继发损伤；⑥凋亡等。在不同致伤条件下，神经细胞凋亡的时间和空间变化会有所不同，但都涉及到多种调控因子的改变。显然，上述各种理论都只从一个侧面描述脊髓继发性损害的机制，但实际上它们构成了一个相互联系的有机整体，共同介导了脊髓继发性损害的病理过程。在这个过程中，氧化及抗氧化作用的平衡失调具有重要的作用。

SOD是机体内重要的抗氧化酶，是人体内源性自由基清除系统的重要组成成分，它的I、II、III 3个大亚基由线粒体基因编码并定位合成，具有酶催化活性。SOD活性水平高低反映了机体内自由基代谢情况，在机体内发挥着不可替代的作用。缺血再灌注时线粒体内产生大量强活性的超氧阴离子自由基，经 SOD作用被歧化成H2O2，后者在过氧化氢酶作用下最终被还原为H2O，从而减轻自由基的损害作用；若SOD活性水平低下，超氧阴离子自由基能够通过Haber-Weiss反应，产生毒性更强的羟自由基[7]。

中性粒细胞是是急性炎症反应的主要细胞，也是第一个达到损伤部位的炎症细胞[8]；MPO是中性粒细胞的特征性酶，存在于嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中，其活性高低反应了中性粒细胞侵润的程度及活性[9]。

本实验发现，在脊髓损伤早期，无论是在损伤后 8小时、1天、3天及7天白藜芦醇及甲基强的松龙都能够明显降低各时间点的MPO活性，提高脊髓组织SOD活性，而且损伤后1天两者作用具有显著性差异﹙＜ 0.05﹚，8小时则表现出效果上差异性，但是损伤3天及7天两者并无差异显著性﹙>0.05﹚，这说明白藜芦醇对MPO及SOD的有效作用时间并不完全相同，并且存在一定程度的差异性。

综上所述，白藜芦醇在脊髓损伤后8小时、1天、3天及 7天能够明显提高脊髓组织中 SOD活性，并抑制MPO的活性升高幅度，与传统药物MPSS的作用效果相似，而且表现出了一定的优异性，这表明两者作用机制可能存在一定的差异。我们推测两者在神经细胞凋亡过程中的作用点可能不同。我们还需要进一步探讨白藜芦醇在脊髓损伤方面的作用机制，并对其提取和入药作进一步研究。

白藜芦醇具有多种有益的生物学效应和较高的使用安全性，可以通过调节脊髓组织的氧化和抗氧化系统的平衡，能够对脊髓损伤后的神经细胞起到保护作用，但是其作用机制的研究有待进一步完善。

[1]Wu Ql,Li QG,Liu K.Stem cell transplantation for treatment of spinal cord injury.Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research,2008,12﹙12﹚:2343.

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[3]赵克森.白藜芦醇的一般生物学作用.国外医学卫生学分册，2002，29﹙6﹚：374-376.

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[5]Pintea A,Rugina D,Pop R.Antioxidant effect of trans-resveratrol in cultured human retinal pigment epithelial cells.J Ocul Pharmacol Ther,2011,27﹙4﹚:315-321.

[6]Li JL.Research Progress on the mechanism of spinal cord injury.Chinese Journal of Practical Nervous Disease,2009,12﹙24﹚ :72-73.

[7]Gomez-Sarosi LA,Strasberg-Rieber M,Rieber M.H2O2preferentially synergizes with nitroprusside to induce apoptosis associated with superoxide dismutase dysregulation in human melanoma irrespective of p53 status:Antagonism by o-phenanthroline.Chem Biol Interact,2010,188﹙1﹚:134-143.

[8]Fudala R,Krupa A,Stankowska D.Does activation of the Fcgamma RIIa play a role in the pathogenesis of the acute lung injury/acute respiratory distress syndrome?Clin Sci﹙Lond﹚,2010,118﹙8﹚:519-526.

[9]Mathias JR,Walters KB,Huttenlocher A.Neutrophil motility in vivo using zebrafish.MethodsMol Biol,2009,571:151-166.