一氧化氮在四磨汤诱导大鼠胃窦平滑肌收缩中的作用*

戴迟兵 刘 娜 钱 伟 侯晓华

华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科（430022）

四磨汤属中医理气剂，主要成分为木香、枳壳、槟榔、乌药，功能破滞降逆，补气扶正，主治七情气逆，上气喘急，妨闷不食。临床实践显示该制剂具有良好的全胃肠促动力效应，但关于其促动力机制的研究目前尚未完善。本课题组的前期研究显示四磨汤主要通过胆碱能毒蕈碱性受体（M受体）[1]以及部分通过烟碱性受体（N受体）[2]促进胃窦平滑肌收缩。然而，作为一种含有多种组分的中药方剂，四磨汤促胃肠动力的作用机制较为复杂，其对胃窦平滑肌收缩活动的兴奋效应可能尚有其他机制参与。有研究[3]发现四磨汤的主要组分槟榔提取物能显著抑制诱生型一氧化氮合酶（iNOS）。鉴于一氧化氮（NO）在胃肠神经介导胃肠平滑肌松弛中起重要中介作用，推测NO可能亦参与了四磨汤对胃窦平滑肌收缩的调节。本研究以NO供体左旋精氨酸（L-Arg）预处理大鼠离体胃窦平滑肌条，探讨NO在四磨汤诱导胃窦平滑肌收缩中的作用。

材料与方法

一、实验动物、主要试剂和仪器

雄性Sprague-Dawley大鼠8只，体质量300～350 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。

四磨汤口服液（生产批号091245-010，国药准字Z20025044，湖南汉森制药股份有限公司）；L-Arg（Sigma-Aldrich Co.LLC.）；Krebs 液：NaCl 119 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,NaH2PO41.2 mmol/L,MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L,C6H12OH611 mmol/L。

25 mL Myobath 4通道组织浴槽、Haake DC10-P5/U恒温水浴箱、FORT1010 g力传感器、SYSTBM4M Transbridge 换能放大器（WPI Inc.）；MP100数据采集系统和AcqKnowledge 3.7.1软件（BIOPAC Systems,Inc.）。

二、实验方法

1.大鼠胃窦平滑肌条的获取和处理：大鼠适应性喂养一周，禁食不禁水24 h，脱颈椎处死后迅速取出鼠胃，沿大弯剪开，以4℃Krebs液漂洗干净，置于硅胶平皿中，大头针固定，分离胃窦，小心去除胃黏膜，以自制双刀（间距2 mm）切取胃窦纵肌条和环肌条（8 mm×2 mm），肌条两端以5-0号丝线结扎。

将肌条悬挂于盛有25 mL Krebs液的组织浴槽中，37℃恒温持续通入含5%CO2、95%O2的混合气体；给予1.0 g前负荷，每20 min更换一次Krebs液，平衡1 h，待肌条收缩活动平衡后开始实验。

2.实验流程：①记录基础状态（给药前）肌条收缩活动5 min，然后依次由低至高累积量加入四磨汤 1、5、25、50、100、150、200 μL，每次加入后记录肌条收缩活动5 min；②以Krebs液洗涤肌条3次，待收缩活动平衡后记录基础状态（给药前）肌条收缩活动 5 min，加入 L-Arg（终浓度 10-4mol/L）后记录肌条收缩活动5 min，然后依次由低至高累积量加入四磨汤（剂量梯度同步骤①），每次加入后记录肌条收缩活动5 min。

3.数据处理：通过AcqKnowledge 3.7.1软件获得不同状态下的5 min肌条收缩曲线下面积（AUC），给药后肌条收缩活性的变化以AUC变化率表示。AUC变化率=（效应值－对照值）/对照值×100%，其中对照值为基础状态5 min肌条收缩AUC，效应值为给药后（加入L-Arg、四磨汤或 LArg+四磨汤后）5 min肌条收缩AUC。

三、统计学分析

结 果

一、L-Arg预处理对四磨汤诱导胃窦纵肌收缩的影响

单用四磨汤能剂量依赖性地促进胃窦纵肌条收缩（F=80.62,P=0.000）。加入 10-4mol/L L-Arg 后，纵肌条收缩活性与基础状态相比无明显变化；继续加入梯度剂量四磨汤，纵肌条收缩活性虽然仍呈剂量依赖性增强（F=66.363,P=0.000），但量效曲线较单用四磨汤显著下移（见图1），表明NO可部分阻断四磨汤对胃窦纵肌的兴奋效应。其中加入LArg+1 μL四磨汤后的纵肌条收缩活性较基础值增加3.43%±0.78%，与单用等剂量四磨汤（增幅6.24%±0.64%）相比差异无统计学意义；四磨汤剂量增至5～200 μL，加入L-Arg+四磨汤后的纵肌条收缩活性增幅均显著低于单用等剂量四磨汤，LArg+200 μL四磨汤的纵肌条收缩活性增幅为组内最高，但仍显著低于单用等剂量四磨汤（48.02%±3.38%对 128.84%±7.47%,P<0.05）。

二、L-Arg预处理对四磨汤诱导胃窦环肌收缩的影响

单用四磨汤能剂量依赖性地促进胃窦环肌条收缩（F=94.01,P=0.000）。加入 10-4mol/L L-Arg 后，环肌条收缩活性与基础状态相比无明显变化；继续加入梯度剂量四磨汤，环肌条收缩活性虽然仍呈剂量依赖性增强（F=73.375,P=0.000），但量效曲线较单用四磨汤显著下移（见图2），表明NO可部分阻断四磨汤对胃窦环肌的兴奋效应。其中加入LArg+1 μL四磨汤后的环肌条收缩活性增幅即已显著低于单用等剂量四磨汤（－2.53%±0.31%对4.56%±0.84%,P<0.05）；L-Arg+150 μL 四磨汤的环肌条收缩活性增幅为组内最高，但仍显著低于单用等剂量四磨汤（39.40%±2.73%对 141.47%±9.05%,P<0.05）。

三、L-Arg预处理后四磨汤诱导的胃窦纵肌、环肌收缩活动的差异

经L-Arg预处理的胃窦平滑肌条，加入低中剂量（1～50 μL）四磨汤后，纵肌条收缩活性增幅显著高于环肌条（1 μL:3.43%±0.78%对－2.53%±0.31%,5 μL:6.02%±0.90%对 1.80%±0.59%,25 μL:14.38%±1.13%对 9.34%±1.01%,50 μL:25.58%±2.16%对 17.66%±1.37%,P均<0.05）；加入高剂量（100～200 μL）四磨汤后，纵肌条与环肌条收缩活性增幅无明显差异（见图3）。单用1～200 μL四磨汤，对纵肌条与环肌条收缩活性的影响无明显差异。

讨 论

NO是肠神经系统中重要的非肾上腺素能非胆碱能抑制性神经递质，可由其前体L-Arg在NOS的作用下转化生成，对胃肠运动具有负向调控作用。本课题组的前期研究[1,2]显示四磨汤主要通过兴奋胆碱能受体对胃窦平滑肌产生促收缩作用。有研究发现抑制内源性NO可增强电场刺激（electrical field stimulation,EFS）诱导的胆碱能反应[4]，并使平滑肌对EFS显现出非胆碱能兴奋效应[5]。鉴于四磨汤的主要组分槟榔提取物能显著抑制iNOS[3]，本研究对四磨汤是否还可通过抑制NO释放调节胃窦平滑肌收缩进行了探讨。

作为NO的前体，L-Arg对静息状态的胃窦平滑肌收缩并无调节作用[6]，本研究结果与之相符。通过本研究数据可发现，以L-Arg预处理大鼠胃窦平滑肌条，外源性NO对经四磨汤作用后处于兴奋状态的平滑肌条产生了明显的抑制效应，但尚不能完全阻断平滑肌条收缩活性增强的趋势，表明抑制NO释放可能是四磨汤促进胃窦平滑肌收缩的机制之一，但并非主要机制。后续研究拟检测四磨汤作用后胃窦平滑肌NO含量的变化，以进一步明确该作用机制。

本研究还发现，在外源性NO的作用下，四磨汤对胃窦纵肌条与环肌条的促收缩作用存在差异。经L-Arg+低中剂量四磨汤作用的环肌条，收缩活性增幅显著低于纵肌条，而单用四磨汤对纵、环肌条收缩活性的影响无明显差异，提示NO在纵、环肌中的作用程度不同，四磨汤对环肌的兴奋效应较纵肌更多依赖于对NO释放的抑制。已知烟碱可刺激人乙状结肠神经释放NO。McKirdy等[7]的研究发现，乙状结肠环肌条对EFS的收缩反应峰值时间（time to peak,TTP）显著长于纵肌条，而NOS抑制剂硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）可显著缩短环肌条的TTP，使之对EFS的收缩反应模式与纵肌条趋于一致；烟碱可显著抑制由EFS诱导的环肌条收缩，对纵肌条收缩则无明显影响，而L-NAME可阻断烟碱对环肌条收缩的抑制作用。上述结果提示神经刺激引起的NO释放在环肌中更为明显，与本研究发现相符。目前虽无直接证据表明NO对胃窦纵、环肌具有不同影响，但关于NO合成相关酶类分布的研究发现，参与从L-瓜氨酸再合成NO前体L-Arg的精氨酸琥珀酸合成酶和裂解酶分布于犬类全消化道环肌神经束，但仅分布于回结肠纵肌[8]；直接参与NO合成的NOS主要分布于鸽全消化道肌间、环肌和黏膜下神经丛[9]。这些发现为本研究推论，即四磨汤对大鼠胃窦环肌的促收缩作用较纵肌更多依赖于抑制NO释放提供了理论上的支持。

综上所述，四磨汤对大鼠胃窦平滑肌具有明显促收缩作用，该作用部分是通过抑制NO释放实现的；四磨汤对胃窦环肌的兴奋效应较纵肌更多依赖于抑制NO释放。关于四磨汤调节胃窦平滑肌收缩的其他机制，尚待进一步研究。

1 戴迟兵，刘娜，陈文妹，等.四磨汤对大鼠胃窦平滑肌影响及其机制的研究[J].胃肠病学,2011,16(10):605-608.

2 钱伟，戴迟兵，陈文妹，等.N受体在四磨汤对胃窦平滑肌影响中的作用[J].胃肠病学和肝病学杂志,2011,20(11):1029-1032.

3 Bhandare A,KshirsagarA,Vyawahare N,etal.Evaluation of anti-migraine potential of Areca catechu to prevent nitroglycerin-induced delayed inflammation in rat meninges:possible involvement of NOS inhibition.J Ethnopharmacol,2011,136(1):267-270.

4 Garella R,Baccari MC.Contribution of endogenous nitrergic and peptidergic influences to the altered neurally-induced gastric contractile responses in strips from dystrophic(mdx)mice[J].Regul Pept,2010,160(1-3):57-63.

5 Shuttleworth CW,Sanders KM,Keef KD.Inhibition of nitric oxide synthesis reveals non-cholinergic excitatory neurotransmission in the canine proximal colon[J].Br J Pharmacol,1993,109(3):739-747.

6 Okuno Y,Kondo T,Saeki A,et al.Colon-specific contractile responses to tetrodotoxin in the isolated mouse gastrointestinal tract[J].Auton Autacoid Pharmacol,2011,31(1-2):21-30.

7 McKirdy HC,Richardson CE,Green JT,etal.Differential effect of nitric oxide synthase inhibition on sigmoid colon longitudinal and circular muscle responses to nicotine and nerve stimulation in vitro[J].Br J Surg,2004,91(2):229-234.

8 Daniel EE, Wang YF, Salapatek AM, et al.Arginosuccinate synthetase,arginosuccinate lyase and NOS in canine gastrointestinal tract:immunocytochemical studies[J].Neurogastroenterol Motil,2000,12(4):317-334.

9 Mirabella N,Lamanna C,AssisiL,etal.The relationships of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-d to nitric oxide synthase,vasoactive intestinal polypeptide,galanin and pituitary adenylate activating polypeptide in pigeon gut neurons[J].Neurosci Lett,2000,293(2):147-151.