RNA干扰抑制IL-23表达对感染后内脏高敏感小鼠肠黏膜固有层DC活化Th17细胞功能的影响*

汪之沫 王文峰 龙艳芹 汪 欢 钱 伟 侯晓华

华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科（430022）

感染后肠易激综合征（postinfectious irritable bowel syndrome,PI-IBS）系指急性胃肠道感染治愈后，部分患者仍存在肠道动力和感觉异常，出现腹痛、腹泻、便秘等肠道相关症状。研究发现PI-IBS患者肠黏膜固有层T细胞浸润增多，伴炎性细胞因子如白细胞介素-1β（IL-1β）等表达增加[1,2]；T 细胞数量减少后，IBS症状随之减轻[3]。本课题组的前期研究[4]通过建立旋毛虫感染后内脏高敏感小鼠模型模拟人类PI-IBS的自然过程，发现模型小鼠肠黏膜固有层树突细胞（DC）诱导活化Th17细胞与肠道感染消退后肠黏膜免疫系统的持续激活有关，源自模型小鼠肠黏膜固有层的DC与脾脏CD4+T细胞共培养能诱导其分化为Th17细胞，使IL-17分泌增多。关于DC活化Th17细胞的具体机制，目前仍不甚清楚，推测可能与DC分泌IL-23有关。本研究应用RNA干扰（RNAi）技术抑制DC分泌IL-23，通过观察经小鼠IL-23小发夹RNA（shRNA）干扰的DC诱导CD4+T细胞分化为Th17细胞功能的变化，探讨感染后内脏高敏感小鼠肠黏膜固有层DC活化Th17细胞的机制，以进一步明确DC在肠道感染消退后肠黏膜免疫系统持续激活中的作用。

材料与方法

一、实验动物分组和造模

雄性SPF级NIH小鼠由武汉生物制品研究所提供，6～8 周龄，体质量（25.0±2.3） g，饲养于华中科技大学同济医学院实验动物学部。旋毛虫幼虫由华中科技大学同济医学院寄生虫学教研室提供。

12只NIH小鼠随机分为两组，每组6只。对照组以0.2 mL 0.9%NaCl溶液灌胃；模型组以0.2 mL含300条旋毛虫幼虫的0.9%NaCl溶液灌胃[5]。8周后处死两组小鼠，取肠道和脾脏进行实验。饲养过程中无动物死亡。

小鼠处死前行结肠气囊扩张腹壁回撤反射（AWR）评分，处死后取空肠、末端回肠、近端结肠、远端结肠标本行组织病理学检查，判断模型组小鼠感染后内脏高敏感模型建立是否成功。具体步骤参照本课题组前期研究[4]。

二、肠黏膜固有层DC和脾脏CD4+T细胞的分离纯化

模型组小鼠处死后浸泡于75%乙醇中3 min，于超净台内取全部空肠、回肠和结肠，PBS充分冲洗，剪成0.5 cm×0.5 cm左右的片状，参照本课题组前期研究[4]步骤获取肠黏膜固有层单个核细胞，以MACS®CD11c 免疫磁珠（Miltenyi Biotec）分选DC，操作按试剂盒说明书进行。所获细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中。流式细胞术检测显示CD11c阳性率为78.85%±10.11%，台盼蓝拒染实验显示细胞活性≥90%。

另取脾脏研碎，参照本课题组前期研究[4]步骤获取单个核细胞，以MACS®CD4免疫磁珠（Miltenyi Biotec）分选CD4+细胞，操作按试剂盒说明书进行。所获细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中。流式细胞术检测显示CD4阳性率为98.40%±1.82%，台盼蓝拒染实验显示细胞活性≥99%。

三、小鼠IL-23 shRNA干扰质粒的构建和鉴定

设计、合成能产生小鼠IL-23 shRNA的两条互补单链DNA模板（A链和B链），A链序列为5′-CACCAGCAGCTCTCTCGGAATCTTTCAAGACG AGATTCCGAGAGAGCTGCT TTTTTT G-3′，B 链序列为 5′-AGCT C AAAAAA AGCAGCTCTCTCGGAATCT CGTCTTGAA AGATTCCGAGAGAGCTGCT-3′，由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。A链与B链互补结合后形成双链DNA模板，结构为CACC+正义序列+发夹环序列+反义序列+终止信号序列+SacⅠ，其中正义序列AGCAGCTCTCTCGGAATCT与小鼠IL-23基因p19亚基的一段序列同源，经BLAST同源序列比对，不与小鼠基因组其他基因序列同源。模板两端引入酶切位点黏端序列以便于与载体连接。同时设计、合成能产生与小鼠IL-23基因无同源序列的无关序列shRNA的两条互补单链DNA模板作为对照。

分别以30 μL退火缓冲液溶解合成的1 OD（1 OD DNA=50 ng/μL DNA）A 链和 B 链基因片段，各取 2 μL，加入 16 μL 退火缓冲液混匀，94 ℃水浴退火，自然冷却至室温。取1 μL退火连接产物，加入99 μL H2O作100倍稀释，－20℃保存备用。

以Eco31Ⅰ酶切线性化pGenesil-1.1质粒表达载体，1%琼脂糖凝胶电泳回收大片段。将上述稀释退火片段与质粒pGenesil-1.1连接，连接反应体系内含稀释退火片段1 μL、质粒pGenesil-1.11 μL、10×连接缓冲液 1 μL、T4 DNA 连接酶 1 μL 和 H2O 6 μL，37℃水浴反应过夜。取5 μL连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含Kanar抗性（终浓度30 μg/mL）的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。挑取单克隆菌落接种于5 mL含Kanar抗性（终浓度30 μg/mL）的 LB 培养液中，37 ℃恒温摇床（7×g）培养过夜。

以质粒小提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]小量提取质粒，SacⅠ酶切鉴定，酶切反应体系内含质粒 DNA 8.5 μL、10×酶切缓冲液 1 μL 和SacⅠ 0.5 μL，37 ℃水浴反应 3 h，1%琼脂糖凝胶电泳。如酶切鉴定显示切下预期大小的片段，则送含有转化质粒的菌液测序（华大基因）。如测序正确，以质粒大提试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]大量提取质粒，测定浓度后－20℃保存备用。

四、DC转染实验

实验设置IL-23 shRNA组（A组）、空脂质体组（B组）和无关序列shRNA组（C组），每组设2个复孔。分离纯化得到的肠黏膜固有层DC培养于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，接种于6孔板，待细胞汇合率达90%时，以LipofectamineTM2000转染试剂（InvitrogenTM,Life Technologies Corporation）转染相应干扰质粒脂质体复合物或空脂质体，操作按试剂盒说明书进行。转染后24 h收获细胞，以细胞计数板计数后备用。收集各组DC转染前和转染后24 h培养上清液，以备检测IL-23水平。此步骤重复3次。

五、转染后DC与CD4+T细胞共培养

A、B、C 三组分别计数 5×105个 DC，与 1.5×106个CD4+T细胞接种于12孔板，以含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基定容至1 mL，另设置CD4+T细胞单独培养组（D组），每组设2个复孔。共培养120 h后收集各组培养上清液，以备检测IL-17水平。此步骤进行3次，分别使用3次转染实验的DC。

六、IL-23、IL-17 水平检测

步骤四、步骤五收集的细胞培养上清液中IL-23、IL-17水平的检测采用ELISA方法（BioSourceTM,Life Technologies Corporation），操作按试剂盒说明书进行，每一标本设2个复孔。

七、统计学分析

结 果

一、感染后内脏高敏感小鼠模型建立

模型组小鼠感染旋毛虫后8周，肉眼观未见肠道水肿，光学显微镜下未见肠黏膜破坏和明显炎性细胞浸润。结肠气囊扩张压力为40和60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）时，模型组 AWR均分显著高于对照组（40 mm Hg:2.41±0.26 对 1.39±0.16,P<0.01;60 mm Hg:3.23±0.37 对 2.72±0.23,P<0.05），个体最低AWR均分（40 mm Hg:2.28±0.19,60 mm Hg:3.15±0.18）亦显著高于对照组（P<0.05）。 表明肠道感染消退后，小鼠内脏敏感性持续增高，提示造模成功。

二、构建质粒的酶切鉴定

质粒pGenesil-1.1的多克隆位点为：-MluⅠ-hU6 promoter-Insert DNA-SacⅠ-，本研究在插入的目的基因片段里设计有一个SacⅠ酶切位点，且质粒pGenesil-1.1本身就有一个SacⅠ酶切位点，如插入正确，质粒就能被SacⅠ酶切出一条约1000 bp的DNA片段。经SacⅠ酶切鉴定，所构建的小鼠IL-23 shRNA干扰质粒和无关序列shRNA干扰质粒均符合设计要求（见图1）。

三、小鼠IL-23 shRNA干扰质粒的测序分析

测序分析结果显示所构建质粒中小鼠IL-23 shRNA模板DNA序列与设计序列完全一致（见图2）。

四、DC培养上清液IL-23水平

转染小鼠IL-23 shRNA干扰质粒的DC，转染后培养上清液中的IL-23水平较转染前显著降低；转染空脂质体或无关序列shRNA干扰质粒的DC，转染前后IL-23水平无明显变化（见表1）。

表1 DC转染前后培养上清液IL-23水平比较（,pg/mL）

表1 DC转染前后培养上清液IL-23水平比较（,pg/mL）

*与同组转染前比较，P<0.05

五、转染后DC与CD4+T细胞共培养上清液IL-17水平

CD4+T细胞与转染小鼠IL-23 shRNA干扰质粒、空脂质体或无关序列shRNA干扰质粒的DC共培养后，共培养上清液中的IL-17水平均较单独培养的CD4+T细胞显著增高[(12.63±0.63)pg/mL、(14.31±0.44)pg/mL 和(14.22±0.53)pg/mL 对(11.15±0.93)pg/mL,P<0.05]，其中IL-23 shRNA组显著低于空脂质体组和无关序列shRNA组（P<0.05），空脂质体组和无关序列shRNA组间差异无统计学意义。

讨 论

PI-IBS是常见功能性肠病IBS的主要亚型，近年研究发现PI-IBS患者的肠黏膜存在由T细胞介导的持续低度炎症[1,2]。DC是肠黏膜免疫系统中最重要的抗原呈递细胞，肠黏膜固有层中存在大量未成熟的DC，摄取抗原后转化为成熟DC。DC在向CD4+T细胞呈递抗原的同时，还能分泌细胞因子诱导CD4+T细胞分化。

CD4+Th细胞作为调节性T细胞中的一个大类，在机体免疫应答、免疫调节等诸多方面发挥重要作用。Th细胞可分为Th1、Th2、Th17三个亚群，三者均由初始型CD4+T细胞分化而成；作为Th17细胞产生的代表性细胞因子，IL-17与自身免疫性疾病密切相关，参与了相关疾病组织炎症的调节[6～8]。研究[9]发现IL-17在T细胞介导的慢性肠道炎症的维持中发挥重要作用。PI-IBS患者的肠黏膜处于持续低度炎症状态，因此Th17细胞可能参与了此种低度炎症状态的维持。

旋毛虫感染后内脏高敏感小鼠模型可模拟人类PI-IBS的自然过程[5]，目前已广泛应用于PI-IBS的研究。本课题组的前期研究[4]显示，小鼠感染旋毛虫后2周，肠黏膜可见典型急性炎症改变，结肠气囊扩张AWR评分提示内脏敏感性增高；感染后8周，肠黏膜已无明显炎症改变，但AWR评分提示内脏敏感性持续增高。感染旋毛虫后8周，小鼠肠黏膜固有层DC与脾脏CD4+T细胞共培养能显著促进IL-17分泌，作用强于感染后2周的肠黏膜固有层DC。上述结果表明在急性炎症期，肠黏膜固有层DC能诱导CD4+T细胞分化为Th17细胞并使之活化，随着肠道炎症的自愈，该作用并不减弱，反而进一步增强，即肠道感染消退后，DC仍能持续有效地活化Th17细胞，这一作用可能对PI-IBS肠黏膜免疫系统的持续激活具有重要意义。

关于PI-IBS时肠黏膜固有层DC活化Th17细胞的具体机制，目前仍不甚清楚。研究[10]发现回肠末端菌群可刺激黏膜固有层DC产生IL-23。IL-23是一个由p19亚基和IL-12p40亚基组成的异源二聚体，属于IL-12细胞因子家族成员[11]，是诱导初始型CD4+T细胞分化为Th17细胞并分泌IL-17的关键细胞因子[6～8]。推测PI-IBS时肠黏膜固有层DC可能系通过分泌IL-23刺激CD4+T细胞分化，诱导活化Th17细胞，参与肠道感染消退后肠黏膜免疫系统的持续激活。

RNA干扰作为一种高效、特异的基因干预工具，目前已广泛应用于各个研究领域。p19亚基为IL-23发挥特异性作用的关键亚基，外周血DC、极化的Th1细胞和激活的巨噬细胞中均可检测到高水平p19表达。因此本研究以小鼠IL-23基因p19亚基的一段序列为靶点设计、构建了小鼠IL-23 shRNA干扰质粒，以高效、特异地沉默小鼠IL-23基因。酶切鉴定和测序分析显示小鼠IL-23 shRNA干扰质粒构建成功，目的序列完全正确。模拟人类PI-IBS的感染后内脏高敏感小鼠模型肠黏膜固有层DC转染小鼠IL-23 shRNA干扰质粒后，培养上清液中的IL-23水平较转染前显著降低，而转染空脂质体或无关序列shRNA干扰质粒的DC转染前后IL-23水平无明显变化，证明所构建的小鼠IL-23 shRNA干扰质粒能有效抑制肠黏膜固有层DC的IL-23表达。经RNA干扰抑制IL-23表达的DC与CD4+T细胞共培养，虽然亦能促进IL-17分泌，但作用显著弱于IL-23表达未受抑制（转染空脂质体或无关序列shRNA干扰质粒）的DC。由此推测感染后内脏高敏感小鼠肠黏膜固有层DC可能通过分泌IL-23刺激CD4+T细胞分化，诱导活化Th17细胞，参与维持肠道感染消退后肠黏膜免疫系统的持续激活；在PI-IBS肠黏膜免疫系统激活的过程中，可能存在着DC-IL-23-Th17-IL-17这一免疫激活通路，当然这并不是惟一的通路。这一发现对进一步认识PI-IBS的发病机制以及探索新的治疗靶点具有重要意义。

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