几种DNA提取方法对红树植物秋茄叶片DNA提取效果的比较

仇建标，丁文勇，陈少波,3，等

(1.浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州 325005；2.浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江温州 325005；3.温州医学院生命科学学院，浙江温州 325035)

红树林是一种热带、亚热带特有的海岸带植物群落。它生长于陆地与海洋交界带的滩涂，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。由于红树林生长在陆海交界处，是陆地的天然屏障，对减少台风等自然灾害造成的破坏有重要的意义[1]；红树林生态系统还具有吸收积累重金属元素、清除有机氯农药改善环境质量的作用；能净化水体过滤陆地径流和内陆带出的有机物质和污染物，降解污染物[2]；在多样性保护方面，它为许多海洋动物、鸟类提供栖息和觅食的理想生境，保护生物多样性和防治病虫害，素有“海底森林”、“水上绿洲”和“潮汐森林”之称，其生物资源量非常丰富，是至今世界上少数几个物种最多样化的生态系统之一[3]。同时，红树林生态系统还具有生态旅游、科学研究、文化教育等重要价值。另外，红树林植物还是重要的化工原料及药物来源。

随着科学技术的发展以及人们对生态环境保护意识的加强，红树林生态系统也越来越成为人们研究和开发的热点，分子水平上对红树林植物的研究也越来越多[4～6]。但是，由于红树植物的特殊性，分子水平上的研究也存在一些难点，其中之一就是红树植物的DNA提取。DNA的分离提取是进行植物分子生物学研究工作的基础，DNA的提取效率和纯度严重影响分子生物学实验的结果，因此快速提取得到高纯度的DNA，是分子生物学实验成败的关键因素之一[7]。

一般陆地植物的DNA提取方法已经非常成熟，常见的有传统的CTAB法、SDS法等。但红树植物因其细胞壁含有大量的单宁和多糖等物质，使其DNA提取存在一定的难度。单宁是一种能与蛋白质和其他化合物形成交联能力的酚化合物，核酸提取过程中，大量的单宁能与蛋白质结合，而且单宁与生物碱和多糖也可发生跟单宁与蛋白质结合相似的复合反应[8]；而大量多糖的存在，使得其与DNA形成共沉淀，从而影响了核酸的纯度[9]。目前国内外最常采用的除多糖的方法是采用经典的CsCl超速离心的方法，但此方法对实验设备和操作技术要求较高，而且花费较高[10]。也有研究人员采用诸如柱过滤等纯化方法[11]，虽然较好地纯化了基因组DNA，但在纯化过程中易造成基因组DNA的损失和断裂，不能够满足如酶切连接等对DNA具有高要求的操作。本文通过比较6种不同的DNA提取方法，采用红树植物秋茄Kandelia candel为实验材料，并用新鲜的的美人蕉Canna indica叶片材料作为对照，探索适合于红树植物DNA提取的方法。

1 材料与方法

1.1 材料：

1）新鲜的美人蕉叶片（标记为M）；

2）干制的红树植物秋茄叶片样本（标记为Q）。

1.2 方法

分别采用以下6种方法，提取美人蕉和秋茄2种材料的基因组DNA。并记录实验过程中观察到的溶液颜色及沉淀形态变化。实验材料统一称取0.2 g组织，提取产物统一用0.1 mL TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA）溶解。6种方法的实验结果分别以M1、M2……M6和Q1、Q2……Q6标示。

方法1：改良SDS法[12]

1）称取0.2 g样本用液氮研磨成粉，加入1 mL提取液（500 mmol/L NaC1，50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，50 mmol/L EDTA，2% β-巯基乙醇）室温数分钟解冻后加入0.5 mL 10%SDS溶液，轻轻混匀于65℃保温30 min；

2）取出后立即置于冰上，加0.24 mL 5 mol/L KAc溶液于冰上反应30 min；10 000 g，4℃离心20 min；取上清液加1倍体积的异丙醇，-40℃放置30 min；10 000 g，4℃离心20 min；

3）用0.5 mL TE缓冲液溶解沉淀，加等体积的氯仿-异戊醇（24:1），混匀；10 000 g，4℃离心10 min；

4）取上清液加0.8倍体积-20℃预冷的异丙醇和1/10体积的3 mol/L NaCl，-20℃静置30 min沉淀DNA；10 000 g，4 ℃离心 20 min；

5）70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干后溶于0.1 mLTE，4℃保存备用。

方法2：高盐低pH法[13-14]

1)称取0.2 g样本用液氮研磨成粉，加入1 mL 65℃预热的提取液（100 mmol/L醋酸钠，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L 氯化钠，3%SDS，1% β-巯基乙醇 pH 5.5）充分混匀于 65 ℃中保温 30 min；10 000 g，4℃离心10 min；

2)取上清液加2/3倍体积的2.5 mol/L（pH=4.8）的KAc溶液，4℃放置15 min；10 000 g，4℃离心10 min；

3)取上清液加等体积的氯仿-异戊醇（24:1），10 000 g，4℃离心20 min；

4)取上清液加等体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置20 min沉淀DNA；10 000 g，4℃离心10 min；

5)用70%的乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干后溶于0.1 mL TE缓冲液。

方法3：传统的CTAB法[15]

1)称取0.2 g样品用液氮研磨成粉，加入1 mL预热的CTAB抽提液（2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0，20m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇），充分混合，于 65 ℃温浴 10～60 min，不时混匀。

2)用等体积的氯仿-异戊醇（24:1）抽提匀浆液，颠倒混合，10 000 g，4℃离心10 min。

3)取上清，加入1/10体积65℃ CTAB/NaCl，颠倒混匀，用氯仿-异戊醇（24:1）抽提，离心回收上清。

4)加入等体积CTAB沉淀液，颠倒混匀，2 700 g，4℃离心5 min。移出上清，用TE缓冲液重悬沉淀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀核酸，充分混合，于10 000 g，4℃离心15 min。

5)用70%乙醇洗涤沉淀，风干后溶于0.1 mL TE缓冲液。

方法4：“海刀豆DNA的提取”方法[16]

1）称取0.2 g样品置于冷研钵中（0～4℃冰浴）加入1 mL研磨缓冲液（0.45 mol/L NaCl，0.45 mol/L柠檬酸钠，0.1 mol/L EDTA，1%SDS，pH 7.0），研磨成匀浆状。

2）加入等体积饱和酚（1 mol/L Tris饱和重蒸酚，pH 8.0），温和摇动10 min，以除去蛋白和使内源DNase（DNA酶）失活。

3）2 500 g，室温离心 10 min，取上清液加 2 倍体积氯仿-异戊醇（24:1），温和摇动 10 min；2 500 g，室温离心10 min，收集上层清液。反复抽提至界面无蛋白为止。

4）加2倍体积-20℃冰冷乙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱过夜，10 000 g，4℃离心10 min，沉淀溶于0.5 mL TE缓冲液，得到粗DNA溶液。

5）往粗DNA液中加灭活的DNase液（RNase溶于0.15 mmol/L NaCl，pH 5.0），终浓度为50 mg/mL，30℃，保温 10 min，除 RNA。

6）加氯仿-异戊醇除蛋白（同3），乙醇沉淀DNA后，10 000 g，4℃离心10 min，风干后沉淀溶于0.1 mL TE缓冲液。

方法5：常用改良的CTAB法[17]

1）称取0.2 g样品，用液氮研磨成粉，加1 mL CTAB抽提缓冲液（2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巯基乙醇），64 ℃保温 30～60 min，并每 10 min 左右翻转 1次。

2）在上述样品中加入等体积Tris-酚和氯仿-异戊醇（24:1），充分混合，10 000 g，4℃离心10 min。

3）取上清，加等体积的CI，10 000 g，常温离心10 min。

4）取上清，加1/5体积3 mol/L NaAc溶液和2倍体积的95%冰冷乙醇，轻微混匀后于-20℃条件下沉淀40 min以上。沉淀后10 000 g，4℃离心10 min。

5）用70%乙醇洗涤沉淀，风干后溶于0.1 mL TE缓冲液。

方法6：针对红树植物优化的CTAB法

1）称取0.2 g样品用液氮迅速充分研磨成粉末，加入1 mL预热的2%CTAB抽提液（2%CTAB，0.1 mol/L tris-HCl pH8.0，20 m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% β-巯基乙醇，2%PVP）。

2）放入水浴锅中 55℃温浴45 min～90 min，并每隔10 min轻轻颠倒摇晃1次，使其充分混合；加入少量 Rnase（RNA酶），37℃保温1～2 h处理；加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分混合，于10 000 g，4 ℃离心10 min。

3）取上清，加入0.5倍体积预热的2%CTAB抽提液，再加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），充分混合，10 000 g，常温离心 10 min。

4）取上清，加入1/5体积5 mol/L NaCl，并加入2/3体积的冰冷异丙醇，轻轻摇晃混合，-20℃条件下放置90 min以上沉淀DNA，10 000 g，4℃离心10 min。

5）弃上清，回收沉淀，用70%乙醇充分洗涤，风干后溶解于0.1 mL TE缓冲液。

1.3 总DNA的定性和定量检测

以1 Kbp DNA Ladder Marker为参照，用1%的琼脂糖凝胶电泳做定性分析。将提取的DNA样品做稀释100倍后，用紫外分光光度法分别测定OD260，OD280值并计算OD260/OD280以检验纯度。

1.4 重复实验

选用DNA提取效果较好的方法，进行重复实验，并采用其它红树植物材料进行DNA提取，验证其DNA提取效果。

2 研究结果

2.1 实验过程中观察结果的比较

从表1可知：不同的DNA提取方法对同一种植物的DNA抽提效果不同[18]，本实验中方法6的抽提效果最明显，抽提后颜色为无色，而其他方法除方法5对新鲜美人蕉材料抽提后颜色为无色外，抽提后都有一定的颜色，说明有叶绿素等蛋白存在。其中以方法1、方法2和方法4颜色最深，表明蛋白质含量较多，抽提效果较差。沉淀物的颜色和形状也与抽提效果具有一致性，方法6沉淀后为少量白色絮状沉淀，表明提取效果较好。方法5中新鲜美人蕉材料沉淀后也为少量白色絮状沉淀，而干制的秋茄叶片样本沉淀后为少量浅黄胶状沉淀，表明方法5对新鲜的一般植物材料提取效果较好，但是对含有较多多糖和单宁的干制红树植物样本提取效果欠佳。其他几种方法所得沉淀中均含有较多有色的杂质，提取效果不是非常理想。

表1 不同提取方法实验过程中的颜色及形态变化Tab.2 Changes of the colors or shapes during the experiment with different methods

2.2 电泳检测结果比较

根据电泳结果（图1）：除方法1外，其他5种方法从新鲜美人蕉材料中提取得到DNA都有条带，方法6所得条带的亮度最大；而从干制的秋茄叶片样本提取的DNA只有方法3、方法5和方法6有条带，而且方法3和方法5的条带亮度都很微弱，只有方法6所得DNA条带较亮。由此可见，方法6所提取DNA的效果最好。

2.3 紫外分光光度法测定结果比较

DNA溶液的纯度用OD260/OD280的比值来表示，当OD260/OD280比值接近1.8时，DNA纯度符合质量标准；当OD260/OD280比值大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染[19-20]。根据本实验中紫外分光光度分析（表2）：方法1中Q1吸光比值较为异常（0.943 1，远小于1.6），可能是因为提取的DNA含有较多的蛋白质、多糖或酚等杂质，用TE溶解DNA后颜色依然较深，从而导致吸光比值异常。M3、Q6、M6吸光比值较接近1.8，表明所提取的DNA质量较好。方法6所提取的DNA的OD260/OD280比值接近1.8，表明所提取的DNA质量较好。

图1 用6种方法提取的基因组DNA电泳图片Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by 6 methods

表2 6种方法所得DNA样品的纯度Tab.2 The purity of extracted DNA by 6 methods

2.4 重复实验结果

采用方法6对秋茄材料进行10次重复实验，并采用其它红树植物材料木榄Bruguiera gymnoihiza、桐花Aegiceras corniculatum、白骨壤Avicennia marina进行DNA提取效果的比较，电泳检测结果（图2）表明：用方法6提取的秋茄DNA纯度较好，提取效果稳定、可靠，并适用于其它红树植物DNA的提取。

图2 方法6提取的基因组DNA电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by Method 6

3 讨论

3.1 选材

实验材料的选择是实验过程的第一步，不同的植物用相同提取方法其DNA纯度和提取率不同，同一植物用不同方法其提取其结果也不一样[18,20]。采用同一植物的不同部位提取的DNA纯度和提取率也不尽相同，一般含较多多糖和单宁的盐生植物如红树植物，取材时应尽量选取处于生长旺盛期的幼嫩组织[21-22]。

本实验中选择美人蕉作为实验对照，美人蕉是一种常见的多年生进立草本植物，所含单宁和多糖的量较少，在一般植物DNA提取上具有代表性。而且，选取的美人蕉材料为新鲜幼嫩的叶片，而秋茄为干制的成熟叶片。由实验结果可知：除方法1外，其它方法提取美人蕉的DNA都有条带，表明常规提取方法对普通植物都是有效的；而对于秋茄，只有方法6提取效果较好，其它方法都欠佳，表明常规提取方法难以从含有大量多糖和单宁的植物中可靠地提取出高质量的DNA。而方法6的提取结果表明了其除多糖的效果较好，即使在无法获得新鲜幼嫩材料时，也可以从成熟的红树植物叶片中提取得到高质量的DNA。

3.2 杂质分离

在DNA的提取过程中，杂质的去除是得到高纯度DNA的关键。实验操作过程中颜色的变化能够在一定程度上反映出杂质去除的效果。本实验列出了抽提后和沉淀后的颜色变化，对比电泳和紫外分光光度检测结果可得：抽提后和沉淀后颜色较深表明杂质去除的效果较差，颜色较浅表明明杂质去除的效果较好。方法6提取过程中颜色最浅，表明其分离杂质的效果最好。

比较6种方法，只有方法6中加入了2%体积的PVP。PVP是一种抗氧化剂，它的主要作用有：与多酚形成一种不溶的络合物，有效去除酚化合物；并且能与多糖结合，使多糖在抽提过程中与DNA分离[23-25]。这对于含有较多酚化合物（如单宁）和大量多糖物质的红树植物干制材料具有非常明显的去除酚和多糖的效果。

方法1～方法5提取得到的DNA因含有大量的多糖和DNA的复合物，从而呈现凝胶状，对后续实验将造成很大的影响。方法6中加入了1/5体积5 mol/L NaCl进行高盐沉淀。利用高盐缓冲条件下，在异丙醇中DNA优先沉淀的性质，达到使DNA与多糖分离的目的，因而在含有大量多糖的红树植物DNA提取过程中，加入5 mol/L NaCl能够有效地去除多糖的影响[26～28]。

此外，方法6中将传统的酚：氯仿抽提法加入等体积的Tris饱和酚换成加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1）。酚具有较强的变性作用，能够除去蛋白质，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%～15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA。而且酚易氧化，氧化后容易降解DNA。因而用氯仿-异戊醇（24:1）代替Tris饱和酚能够提高DNA的得率。而且氯仿-异戊醇比Tris饱和酚毒性小，使实验过程更具安全性。

方法1为传统的SDS法，在动植物DNA的提取中都有所应用，但是在动物DNA提取中应用较为广泛。在本实验中，方法1的DNA提取效果较差，可能原因是：1）SDS对蛋白质的去除效果较好，但是对植物中复杂的多糖和单宁的去除效果不够好；2）沉淀后用TE溶解再抽提，DNA损失较多，对DNA提取得率影响较大，因此秋茄和美人蕉样品都未能提出DNA。

方法2、方法3和方法5都没有专门除多糖的步骤，所以对红树植物的DNA提取效果都欠佳。而方法4是针对红树植物海刀豆的提取方法，其使用的研磨缓冲液主要成分是柠檬酸钠，能较干净地去除蛋白质[16]，但是其对多糖的去除效果不好。而且与方法1类似，其沉淀后用TE溶解再抽提，对DNA造成的损失较大。

4 小结

通过6种不同的DNA提取方法的比较可知：自行改进的CTAB法（方法6）最适合红树植物DNA的提取。方法6通过PVP的除酚去多糖作用，利用CTAB提取液和氯仿-异戊醇强效除蛋白和脂类物质，结合高盐沉淀除去多糖，以及异丙醇高效沉淀DNA，最终较彻底去除杂质，得到高纯度的基因组DNA。方法6还解决了实验取材的限制，在无法满足新鲜幼嫩材料时，也可以采用干制的材料提取得到较好的DNA。而且通过重复实验，得到的DNA条带电泳检测结果都较好，说明此方法较可靠、稳定。通过用此方法对其它种类红树植物材料进行DNA提取，得到的DNA条带电泳检测结果也都较好。加上此方法操作简单，安全快速，综上说明方法6是一种适合于红树植物DNA提取的方法。

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