GC-MS法测定腌制水产品中3种N-亚硝胺含量

王秀元，赵 华，蒋玲波，方 益，张薇英，王萍亚

（1.浙江海洋学院食品与药学学院、医学院，浙江舟山 316004；2.浙江舟山市质量技术监督检测研究院，浙江舟山 316021）

腌制是一种传统的加工保藏方法，可以提高食品的防腐性能，延长保质期，改善产品风味，其在水产品加工中应用频繁。腌制水产品因其风味独特，深受世界各地人民的青睐[1－3]。但腌制水产品的安全性问题颇具争议，特别是腌制水产品的过程中，会产生含有致癌作用的亚硝酸盐和由此转化生成的N－亚硝胺类化合物[4－6]。相关文献资料表明，人类是N－亚硝胺引起癌症的易感群体[7]。在习惯吃腌制水产品的沿海地方，鼻咽癌和胃癌发病率非常高。针对此现象许多学者研究了某些地区的海产品中硝酸盐、亚硝酸盐、N－亚硝胺的含量调查，结果从腌制水产品中检测到了不同水平的强致癌物质N－亚硝胺[8－10]。

目前国内外对腌制水产品中N－二甲基亚硝胺（NDMA）、N－二乙基亚硝胺（NDEA）的研究较多[11－12]，GB2762－2005《食品中污染物限量》规定了腌制生食水产品中NDMA、NDEA的限量标准分别为NDMA≤4 μg/kg，NDEA≤7 μg/kg[13]，但常用的方法分析时间长，“气相色谱－热能分析仪”使用率低，因此本研究建立一种适用于腌制水产品中多种N－亚硝胺的高灵敏度快速检测方法。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

1．1．1 主要仪器

气相色谱－质谱联用仪（GC/MS），Agilent GC7890A/MS5975C，美国Agilent公司；固相萃取装置，美国VISIPRETMDL；高速冷冻离心机，SER JSE09L31，USA；数控超声波清洗器，KQ5200DE，昆山市超声波仪器有限公司。

1．1．2 试剂

标准品：N二甲基亚硝胺（纯度98．0%）由美国CIL提供；N－二乙基亚硝胺（纯度99．9%）、N－二丙基亚硝胺（纯度99．9%）由美国SUPELCO公司提供；二氯甲烷：色谱纯；无水硫酸钠：分析纯。

1．2 试验方法

1．2．1 色谱条件

色谱柱：DB－WAX，30 m×0．250 mm×0．25 μm；进样口温度：250 ℃；载气：He（纯度＞99．999%）；隔垫吹扫流量：3 mL/min；不分流进样；升温程序：起始温度50℃，保持3 min，以10℃/min升温至110℃，再以15℃/min升温至200℃，再以40℃/min升温至240℃；自动进样，进样量1 μL。

1．2．2 质谱条件

电离方式：电子轰击（EI）离子源；电子能量：70 eV；电子倍增器电压：1 671 V；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；接口温度：240℃；SIM采集模式，扫描质量范围：m/z 40～350；溶剂延迟：4 min；采样频率：2。

上述条件下，3种N－亚硝胺的保留时间和定性定量离子见表1。

表1 3种N－亚硝胺物质的保留时间和定性定量离子表Tab．1 Retention time and GC/MS acquisition parameters for three N－nitrosamines

1．2．3 标准溶液制备

分别准确称取3种N－亚硝胺标准品0．1 g（精确到0．000 1 g），用二氯甲烷定容至50 mL，得到N－亚硝胺标准储备液，浓度为2．0 mg/mL。准确移取上述标准储备液，以二氯甲烷逐级稀释配制N－亚硝胺：10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL 系列混合标准溶液，按 1．2．1 色谱条件和 1．2．2 质谱条件上机进样，进样量1 mL，以混合标准品浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 样品溶液制备及前处理

称取粉碎的腌制水产品样品20.0 g，置于50 mL具塞离心管中，加入二氯甲烷30 mL，于IKA振药器上涡旋1 min，保持温度在30℃以下超声提取30 min，低温条件下离心10 min，分出有机相溶剂，再提取2次，每次约20 mL二氯甲烷，合并有机溶剂相，通过固相萃取技术净化萃取样品，经无水硫酸钠脱水，于40℃水浴下真空浓缩至近干，定容1.0 mL，备用。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的优化

考察了不同极性的气相色谱柱（非极性柱DB-5MS：30 m×0.250 mm×0.25 μm、强极性柱DB-WAX：30 m×0.250 mm×0.25 μm）对待测N-亚硝胺类物质的分离效果。结果表明：选用非极性柱时，色谱峰分离度也不好，N-二甲基亚硝胺的色谱峰与溶剂峰分不开；而选用强极性柱DB-WAX时，获得的色谱峰峰形对称、定量准确、重现性好、分离效果好。因此，本试验选用DB-WAX作为色谱柱。

2.2 柱温升温速率的优化

由于溶剂峰对对待测物质出峰的影响，因此需要优化柱温的升温速率，以获得最佳分离效果。选择柱温起始温度为50℃，分别比较了升温速率为15℃/min、10℃/min、5℃/min时分离效果，实验结果显示：当升温速率为15℃/min时，溶剂峰与N-二甲基亚硝胺的色谱峰无法明确分出；当升温速率为10℃/min时，能够有效分离，而继续降低升温速率为5℃/min时，色谱峰的分离效果没有明显改善，因此选择升温速率为10℃/min。当柱温升高到110℃时，N-二甲基亚硝胺的色谱峰已出峰，因此为了提高分析速度，将升温速率提高为15℃/min。因此，最终选择柱温为：起始温度50℃，保持3 min，以10℃/min升温至110℃，之后以15℃/min升温至200℃，再以40℃/min升温至240℃。

按照上述优化条件，选择电子轰击电离源（EI），电子能量为70 eV，采集模式为SIM，对3种N-亚硝胺混合标样分析，得到标准品的保留时间和特征离子见表1，气相色谱-质谱总离子流图如图1所示（浓度为200 ng/mL）。

图1 3种N-亚硝胺标准品的气相色谱-质谱总离子流图（浓度为200 ng/mL）Fig.1 Total ion current chromatogram of three N-nitrosamines（c:200 ng/mL）

2.3 前处理条件的选择

2.3.1 样品提取方法的优化

考察了分别选用水蒸气蒸馏法和超声振荡提取法对样品进行前处理，结果表明：超声振荡提取法获取N-亚硝胺比水蒸气蒸馏法提取更完全，且操作简捷，因此，选择超声振荡法提取样品中的N-亚硝胺类物质。

2.3.2 固相萃取小柱的优化

本实验比较了5种固相萃取小柱净化的效果。样品加入适量N-亚硝胺混合标样溶液，方法同1.2.4。通过比较每个萃取小柱所萃取的3种亚硝胺的回收率来确定最佳的萃取小柱，平行3次试验，结果取平均值，作表2。由表2可以看出，选取活性炭固相萃取小柱效果较好，因此，本试验采用活性炭萃取柱。

表2 5种固相萃取小柱萃取效果比较图Tab.2 Comparison of clean-up effects of five SPE cartridges

2.4 工作曲线及检测限

本方法采用外标法定量，配制5种N-亚硝胺的质量浓度为10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL系列混合标准溶液，利用定量离子峰面积绘制标准曲线。每个质量浓度的样品测定3次，以目标物的峰面积Y对其质量浓度X进行回归分析，得到各N-亚硝胺的线性方程、相关系数和线性范围见表2，3种化合物的选择性离子色谱图和扫描质谱图如图2～4所示。

表3 3种挥发性N-亚硝胺线性方程、相关系数、线性范围及检测限Tab.3 Regression equationgs,correlation coefficients,linear ranges and LOQs for three N-nitrosamines

图2 NDMA选择性离子色谱图A和扫描质谱图B（9.671 min）Fig.2 NDMA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(9.671 min)

图3 NDBA选择性离子色谱图A和扫描质谱图B（10.775 min）Fig.3 NDBA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(10.775 min)

图4 NDPA选择性离子色谱图A和扫描质谱图B（12.405 min）Fig.4 NDPA chromatogram(A)and mass spectrogram(B)of MIB(12.405 min)

由表3可知，本方法重现性好，线性范围广，相关系数可达0.999 5以上，检测灵敏度高，检测限：NDPA为1 ng/mL，NDMA、NDEA为2 ng/mL，达到ppb级。

2.5 回收率及精密度试验

选择腌制泥螺样品进行加标回收试验，加混合标样200 ng/mL，各进行6次样品测定，同时做空白样试验，检测其本底成分，结果见表4。

表4 回收率及精密度（n=6）Tab.4 Precision and recovery for three N-nitrosamines（n=6）

由表4可知，本试验采用的样品处理方法，能够达到国家标准规定的要求。

2.6 样品测定分析

取3种比较常见的舟山腌制水产品样品：鳕鱼、鮟鱇鱼、泥螺，分别编号：①、②、③，按1.2项试验方法分别测定挥发性N-亚硝胺的含量，每个样品平行3次，结果见表5，其中腌制泥螺的选择离子色谱图如图5。

表5 实际样品中3种挥发性N-亚硝胺含量测定Tab.5 Determination results of three N-nitrosamines in real samples

3 结论

本研究建立了一种适用于气相色谱-质谱联用法测定腌制水产品中3种N-亚硝胺的分析方法。比较了不同提取方法、不同固相萃取小柱、不同色谱柱对分离检测的影响，结果表明：以二氯甲烷作为溶剂提取腌制水产品中的N-二甲基亚硝胺（NDMA）、N-二乙基亚硝胺（NDEA）、N-二丙基亚硝胺（NDPA）3种化合物，采用超声振荡法提取，选用活性炭萃取小柱，DB-WAX（30 m×0.250 mm×0.25 μm）色谱柱，分离效果良好。该方法前处理更简单快速，且易于操作，重现性好，回收率可观，在86%～99%之间，线性范围10～1 000 ng/mL，方法灵敏度高，检测限：NDPA为1 ng/mL，NDMA、NDEA为2 ng/mL，达到ppb级，并在实际样品分析中应用良好，可适用于腌制水产品中N-亚硝胺物质含量的测定分析。

图5 腌制泥螺的选择离子色谱图Fig.5 SIM chromatogram of salted snail

[1]HONIKEL K.The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat products[J].Meat Science,2007,78:68-76.

[2]陈维娟.咸鱼深加工工艺探讨[J].中国水产,2002(4):74-75.

[3]李基银.腌菜质量与卫生[M].北京:轻工业出版社,1988:128-172.

[4]YURCHENKO S,MOLDER U.The occurrence of volatile N-nitrosaminesin Estonian meat products[J].Food Chemistry,2007,100:1 713-1 721.

[5]杨 华,马俪珍,王 瑞,等.肉制品中N-亚硝胺及亚硝酸盐测定及其相关性分析[J].保鲜与加工,2006,35(4):21-23.

[6]王绍云.腌鱼、腌肉中亚硝酸盐及硝酸盐含量的测定[J].贵州师范大学学报:自然科学版,2004,22(2):87-89.

[7]吴永宁.现代食品安全科学[M].北京:化学工业出版社,2003:248-259.

[8]马俪珍,南庆贤,方长法.N-亚硝胺类化合物与食品安全性[J].农产品加工学刊,2005(12):8-14.

[9]方长发,马俪珍,刘会军,等.固相微萃取技术及其在N-亚硝胺分析中的应用[J].肉类研究,2008(4):49-53.

[10]樊丽琴,杨贤庆,陈胜军,等.腌制水产品中N-亚硝基化合物的研究进展[J].食品工业科技,2009(4):360-363.

[11]魏法山,徐幸莲,周光宏.挥发性N-亚硝基化合物的分析方法[J].食品科学,2008,29(7):484.

[12]吉林省卫生防疫站.GB/T 5009.26-2003食品中N-亚硝胺类的测定[S].北京:中国标准出版社,2004.

[13]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,卫生部卫生监督中心.GB 2762-2005食品中污染物限量[S].北京:中国标准出版社,2006.