EGCG经NF-кB途径抑制肝癌HepG2细胞增殖的研究

方志雄，程 丹，罗招阳

1.湖南湘潭市中心医院肝病科，湖南 湘潭 411100;2.湖北黄石市传染病院肝病科;3.南华大学医学院病理教研室

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病呈逐年上升趋势［1］。由于其早期症状不明显，大部分患者就诊时已为晚期，因此，化疗成为肝癌治疗的重要手段［2］。然而，许多患者因无法耐受化疗药物的毒副作用，致使临床疗效难尽人意［3］。因此，寻找有效、低毒的抗癌药物，成为肿瘤研究的热点之一。本文旨在初步探讨EGCG抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 肝癌HepG2细胞购自中科院上海细胞库，用含10%小牛血清(杭州四季青公司产品)的RPMI 1640培养基置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.2 EGCG EGCG为美国Sigma公司产品(纯度﹥98%)，将其溶于PBS溶液中，过滤除菌后于4℃保存备用。

1.3 绘制细胞生长曲线 取对数生长期HepG2细胞，按2×103个/孔接种于24孔板，加入 EGCG至50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS 为阴性对照组)，每组设3个平行孔。每天取3孔计数细胞，每孔计数3次，计算细胞数的均值，连续6 d，绘制EGCG抑制HepG2细胞的生长曲线。

1.4 平板克隆形成实验 取对数生长期HepG2细胞，按500个/孔接种于6孔板中，加入EGCG至50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS为阴性对照组)，每组设3个平行孔。培养2周后取出培养皿，甲醇固定后，0.4%结晶紫染色，计数细胞克隆数，按公式计算EGCG抑制HepG2细胞的抑制率IR:抑制率IR(%)=［1－(克隆数/接种细胞数)］×100%。

1.5 软琼脂集落实验 用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基、0.6%琼脂糖配制底层琼脂，取2 mL铺于6孔板内，然后用HepG2细胞(密度为2×104个细胞/孔)、50.0 mg·L－1EGCG 培养液(≈IC50值)、0.3%琼脂糖配制顶层琼脂，每组设3个平行孔，37℃，5%CO2温箱内培养2周后，计数集落数和抑制率IR值:抑制率IR(%)=［1－(处理组集落均数/阴性对照组集落均数)］×100%。

1.6 Western blot检测蛋白表达 取对数生长期HepG2 细胞，加入 EGCG 至 50.0 mg·L－1(≈IC50值，PBS为阴性对照组)培养48 h，收集细胞，裂解，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，以各泳道30 μg的总蛋白量进行10%SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，转膜、封闭，一抗(1∶1000)室温孵育滤膜1 h，PBS洗膜，HRP标记的二抗(1∶1000)室温孵育滤膜1 h，洗膜后进行ECL化学发光、X光片曝光并显影、定影，分析结果。

1.7 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件处理所有的数据，数据用表示，所有的数据均采用χ2和T-test法进行分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG抑制HepG2细胞增殖的生长曲线 每天计数细胞数，观察EGCG抑制HepG2细胞增殖的情况。结果发现，与阴性对照组比较，EGCG处理HepG2细胞后，细胞生长减慢(n=3，P＜0.05)，说明 EGCG可有效抑制HepG2细胞的增殖，随着作用时间的延长，HepG2细胞增殖抑制作用更显著(见图1)。

图1 EGCG抑制HepG2细胞增殖的生长曲线 (与对阴性照组比较，#P ＜0.05)Fig 1 Growth curve of EGCG inhibited the proliferation of HepG2 cells

2.2 EGCG对HepG2细胞平皿克隆形成的抑制作用 结果显示，与阴性对照组比较，EGCG处理组细胞克隆体积小，数目少，说明EGCG可有效抑制HepG2细胞的增殖(见图2、表1)。

表1 EGCG处理后HepG2细胞的平皿克隆数统计Tab 1 Clonal number of HepG2 cells dealt with EGCG

2.3 EGCG对HepG2细胞集落形成的抑制作用取对数生长期HepG2细胞，通过软琼脂集落形成实验观察EGCG处理HepG2细胞后的集落形成情况。结果显示，与阴性对照组比较，EGCG处理组的细胞集落体积小，数目少，说明EGCG对HepG2细胞集落形成具有抑制作用(见图3、表2)。

表2 EGCG处理后HepG2细胞的集落形成数统计()Tab 2 Statistics of EGCG inhibited cell colony forming number of HepG2 cell

表2 EGCG处理后HepG2细胞的集落形成数统计()Tab 2 Statistics of EGCG inhibited cell colony forming number of HepG2 cell

与阴性对照组比较，#P＜0.05

分组 软琼脂集落形成数()抑制率(%)阴性对照组926 ±146 4.63 EGCG处理组 624±112#3.12

2.4 EGCG 处理后 HepG2细胞中 NF-кB P65蛋白的表达 结果显示，与阴性对照组比较，EGCG处理后NF-кB P65蛋白表达降低(见图4)，提示EGCG可能通过抑制NF-кB P65蛋白表达而发挥抑制HepG2细胞的增殖。

图4 Western blot检测EGCG处理后HepG2细胞中NF-кB P65蛋白的表达 A:阴性对照组;B:50.0 mg·L－1EGCG处理组Fig 4 Detection of the expression of NF-кB P65 protein in HepG2 cells inhibited by EGCG with Western blot A:negative control;B:50.0 mg·L－1EGCG group

3 讨论

众所周知，大多数天然植物具有低毒性的特点，从天然植物中分离和筛选抗肿瘤的有效成分，并探讨其抗肿瘤作用机制，为当前肿瘤药物学的研究热点之一。近年来，从不少天然植物中筛选的有效成分能有效抑制肿瘤细胞的增殖，这为临床防治肿瘤提供了新的思路，如从喜树中筛选的羟基喜树碱［4］，三尖杉中分离的三尖杉酯碱［5］等能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。

茶作为广泛流行和人们喜好的三大饮料之一，可有效预防和治疗多种肿瘤。茶作为天然植物的抗肿瘤作用，是目前肿瘤防治领域中的热点之一，尤其是绿茶的研究最多。绿茶的多种成分具有多种生物活性和有效的抗肿瘤作用，其中表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG］含量最高，生物活性最强，抗肿瘤作用也最明显［6-9］。我们首先通过MTT法检测了EGCG抑制HepG2细胞增殖的IC50值为50.24 mg·L－1(结果没有显示)，在后续的实验研究中，选取50 mg·L－1EGCG作为近似的IC50值。

肿瘤细胞集落形成能力是肿瘤重要的恶性特征之一，其与肿瘤的发生、发展及转移能力密切相关，是体外筛选抗肿瘤药物的重要方法。我们通过细胞生长曲线、平皿克隆和软琼脂集落形成实验检测了EGCG抑制HepG2细胞的增殖作用，研究结果显示EGCG能有效抑制HepG2细胞的增殖，这与以往许多报道EGCG的抑瘤作用基本相似相似［7-9］。

核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是一个高度保守的重要转录因子家族，1986年由Sen和Bakimore首次报道，因参与B细胞κ轻链的表达调控而得名。NF-κB形成同源或异源性二聚体发挥转录功能，p65和p50是其最重要的两个亚基［10］。调控NF-κB激活的信号通路有两种:一种是IκB依赖性经典途径;另一种是非经典途径。在经典途径中，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)在外源性刺激下被磷酸化和泛素化，从p50/p65异二聚体/IκBα复合物中解离下来，p50/p65异二聚体便通过核膜转位进入细胞核，与靶基因启动子区域的9～11个核苷酸构成的κB结合位点结合诱导靶基因的转录［11］。为进一步了解EGCG抑制HepG2细胞增殖的具体机制，采用Western blot检测了EGCG处理前后HepG2细胞中NF-кB P65蛋白的表达情况。结果显示，EGCG处理后HepG2细胞中NF-кB P65蛋白的表达降低。结合EGCG能有效抑制HepG2细胞的增殖作用，我们推测EGCG抑制NF-кB P65蛋白表达可能是其发挥抑制HepG2细胞增殖的机制之一，其中可能涉及NF-кB P65蛋白调控的复杂信号网路，仍有待我们进一步深入研究。

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