胶体金法检测在判定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的价值探讨

林 翀 苏应仙 林明冠 张天蔚

海南省农垦总局医院检验科，海南海口 570311

金黄色葡萄球菌（staphyloccocus aureus）是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染[1]。随着抗菌药物的种类不断增加及临床广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在全球范围内不断增加，成为院内、外感染的重要病原菌之一。2001年我国的全国调查报告显示，MRSA在金黄色葡萄球菌中所占的比例波动在40%～90%之间[2-3]。本研究通过比较苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法判定MRSA株的情况，旨在探讨胶体金法检测判定MRSA株的价值，现将相关的临床资料总结并报道如下：

1 资料与方法

1.1 菌株来源

收集2008年3月～2009年2月从我院住院或门诊患者的痰液、清洁中段尿、脓液等各种临床标本中分离出的金黄色葡萄球菌75株，质控菌采用金黄色葡萄球菌ATCC25923，购于卫生部临床检验中心，以2010年CLSI为判断标准。

1.2 方法

将收集到的75株金黄色葡萄球菌分别采用苯唑西林（1 μg/片）药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法检测。

1.2.1 苯唑西林药敏纸片扩散法 采用苯唑西林药敏纸片扩散法检测75株金黄色葡萄球菌，若苯唑西林药敏纸片抑制圈的直径≤10 mm，可判断为MRSA。苯唑西林药敏纸片由Oxoid公司提供，在有效期内使用。

1.2.2 乳胶凝集法 首先提取标本中的PBP2a蛋白，然后用包被有抗PBP2a单克隆抗体的乳胶颗粒进行凝集检测。乳胶试剂反应圈产生凝集时为PBP2a阳性，菌株为MRSA。乳胶凝集试剂由Oxoid公司提供，严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 胶体金法 提取标本中的PBP2a蛋白，加样于检测试纸条，试纸条检测带和质控带均有显色条带则为阳性，即判断为MRSA，仅质控带显色条带的为阴性，如质控带未出现条带，则为体系失效[4]。采用北京青元盛康生物医药有限公司生产的MRSA胶体金法试剂盒，严格按说明书进行操作。

1.3 观察指标

观察苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法的检测MRSA的敏感度及检测时间并进行比较分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，三组间比较采用方差分析，组间两两比较，采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种方法检测MRSA敏感度及符合率情况

苯唑西林药敏纸片扩散法和胶体金法的检测敏感度均高于乳胶凝集法，但经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）；胶体金法与苯唑西林药敏纸片扩散法检测MRSA的符合率高达100.0%。见表1。

表1 三种方法检测MRSA的敏感度比较（株）

2.2 三种方法检测时间比较

苯唑西林药敏纸片扩散法的检测时间为（1080.6±36.3）min，乳胶凝集法的检测时间为（38.2±1.7）min，胶体金法的检测时间最短，仅为（9.2±0.4）min，胶体金法与苯唑西林药敏纸片扩散法及乳胶凝集法比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

目前临床上由于MRSA的出现致使感染趋势不断上升，多重耐药性增加，现有的抗生素很难控制这些耐药菌株的感染，正确快速的检测MRSA并找出有效控制其感染的药物，是目前临床微生物工作的任务之一。本研究通过比较苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法判定MRSA株的情况，探讨胶体金法检测在判定MRSA株中的价值。

根据苯唑西林药敏纸片抑制圈≤10 mm来判断MRSA是一种简便的方法，但耗时长，而且容易受到如培养基、细菌接种量、药物浓度及培养时间的等诸多因素的影响。做好培养基的室内质控是准确判断MRSA的重要手段，但花费的时间更长，不利于为临床MRSA检测提供准确而快速的诊断。

乳胶凝集法快速、简便，且无需特殊仪器和技术，对临床早期检出MRSA很有帮助，但检测成本高，且因为PBP2a的低表达可能会产生假阴性[3]。

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点[5]，近年已在各种生物学研究中广泛使用，在临床使用的免疫印迹技术中几乎都使用其标记。同时，在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中均可能用到。胶体金是金的水溶胶，胶体金法是指以胶体金为显色标记物的检法方法[6]。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成的一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。除了与蛋白质结合以外，胶体金还可以与许多其他生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。杜玉萍等[7]以金黄色葡萄球菌菌体抗原免疫家兔获得多克隆抗血清，利用胶体金免疫层析技术，采用二步法检测金黄色葡萄球菌，建立的胶体金免疫层析试纸法能在60 min内完成检测，灵敏度实验结果显示其检测灵敏性为1×106cfu/mL；特异性实验检测显示其与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B型等菌无交叉反应，但与耶尔森氏菌、大肠杆菌标准株（ATCC25922）、铜绿假单胞菌标准株（ATCC27853）有一定交叉。有学者用胶体金标记产肠毒素金黄色葡萄球菌多价抗体，先制成胶体金探针，进而制成检测产肠毒素金黄色葡萄球菌免疫层析法（GICA）检测试纸条，用该法检测产肠毒素葡萄球菌，具有简便、快速、特异性好、无需仪器及细菌抗原无需进行特殊处理等优点，预示着本方法具有广阔的应用前景[8-10]。

本组实验结果显示，胶体金法和苯唑西林药敏纸片扩散法的符合率达100%，两者敏感性均高于乳胶凝集法，但差异无统计学意义（χ2=0.260，P＞0.05），且胶体金法的检测时间最短，仅为（9.2±0.4）min。

综上所述，胶体金法是一种快速、准确的判定MRSA菌株的方法，值得进一步研究。

[1]刘兰芳，郭思健.438株金黄色葡萄球菌耐药性分析[J].南华大学学报：医学版，2004，32（4）：510.

[2]马越，金少鸿.我国细菌耐药性监测研究的新特点[J].中华检验医学杂志，2005，28（4）：344-348.

[3]张国祥.112例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的临床特征[J].中外医学研究，2010,8（23）：77-78.

[4]邵军军，常惠芸.胶体金免疫层析试纸条在病原体检测及医学诊断中的应用[J].实用诊断与治疗杂志，2008，22（1）：39.

[5]陈映红.胶体金法检测HBsAg的方法学评价[J].现代医药卫生，2009，25（14）：2196.

[6]宗扬勇，朱爱娟.胶体金法在梅毒实验诊断中的应用价值[J].现代中西医结合杂志，2009，18（4）：430.

[7]杜玉萍，陈清，王雅贤，等.胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究[J].热带医学杂志，2006，6（6）：650-652.

[8]许保疆，郭成留.免疫层析快速诊断试纸条的制备及在动物疫病诊断上的应用[J].中国畜牧兽医，2009，36（3）：48.

[9]王清，吴振廷，王学林，等.免疫胶体金标记技术及其在植物保护上的应用前景[J].安徽农业科学，2005，33（3）：485.

[10]许欣，王锋.免疫胶体金技术及其在临床诊断上的研究进展[J].江西农业学报，2009，21（6）：125.