盐酸戊乙奎醚对脓毒血症大鼠外周血内皮细胞及其微粒计数的影响

刘 笋 艾宇航 覃双全

1.中南大学湘雅医院重症医学科，湖南长沙 410008；2.湖南省常德市第一人民医院急诊科，湖南常德 415000

脓毒血症及序贯发生的多脏器功能障碍是重症监护室患者死亡的主要原因。近年来的研究表明，参与脓毒血症的细胞中，血管内皮细胞（CECs）非常关键。脓毒血症时的CECs在形态、寿命和功能方面都发生改变。脓毒血症时CECs及微粒（EMPs）数量升高，且其数量变化与病情的严重程度及预后相关。盐酸戊乙奎醚是我国具有独立知识产权的新一代高选择性抗胆碱药物，具有很强的抗胆碱作用，作用全面，持续时间长，大量研究显示在缺血再灌注损伤和围术期器官功能保护上发挥重要作用。本研究从对内皮细胞的影响进一步探讨其保护作用，为临床应用提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性 SD 大鼠 120 只，体重（200±70）g，术前禁食 8 h，禁饮4 h。

1.2 试剂

IL-6、TNF-α试剂盒（武汉博士德生物工程研究所）；基质显色鲎试剂盒（厦门鲎试剂实验厂有限公司）；FcRblocking试剂（Miltenyi公司，德国）；Histopaque-1077（Sigma 公司，美国）；PE标记的抗人 CD146单克隆抗体，PE标记的抗人CD146单克隆抗体（BD公司，美国）。

1.3 实验分组及处理

随机将其分为六组：①生理盐水对照组（sham组）：假手术+生理盐水 2 mL；②CLP组：CLP+生理盐水 2 mL；③PHC0.1组：CLP+PHC0.1mg/kg；④PHC0.5组：CLP+PHC0.5mg/kg；⑤PHC1.0组 ：CLP+PHC 1 mg/kg；⑥PHC2.0组：CLP+PHC 2 mg/kg。

1.4 脓毒血症动物模型制备

大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，钝性分离右侧颈外静脉，置管备输液使用。盲肠结扎穿孔CLP模型[1]，即沿腹部正中切开2 cm腹壁，暴露盲肠，距回盲瓣远端结扎盲肠，结扎长度为10 mm，然后用18口径穿刺针单次穿刺被结扎盲肠，由穿刺孔挤出粪便进入腹腔，后将盲肠送回原位，双层缝合腹壁。假手术组只切开腹壁再双层缝合，盲肠不作结扎穿孔。CLP手术在10 min内完成。所有操作结束后大鼠保温静置3 h。3 h后，PHC0.1组、PHC0.5组、PHC1.0组、PHC2.0组分别经右颈外静脉输注 0.1、0.5、1.0、2.0 mg/kg（均用生理盐水稀释至2 mL）；CLP组及生理盐水对照组均输注生理盐水2 mL。实验过程中大鼠直肠温度维持（37.0±0.5）℃。

1.5 标本采集及处理

各组随机各取20只观察CLP或者假手术术后6、12、24、48、72 h存活率。各组余下均在行生理盐水或者盐酸戊乙奎醚处理后3 h颈外静脉采血2 mL离心分离血浆和血细胞，血细胞用于检测CECs，血浆用于检测TNF-α、IL-6和LPS，另取1 mL血液高速离心后，分离血浆，用于EMPs的检测。

1.6 观察指标

ELISA法检测血浆TNF-α、IL-6，鲎试剂基质终点显色法测定血浆LPS含量；流式细胞学检测CECs和EMPs，严格按各试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法

使用SPSS 13.0统计软件，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组生存率比较

各个时间点CPL组均较sham组生存率低，而使用盐酸戊乙奎醚各组间及与CPL组比较，生存率差异均无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

2.2 血浆TNF-α、IL-6和LPS含量，外周血CECs和EMPs计数

各项指标CPL组全部高于sham组；TNF-α、IL-6水平和外周血CECs和EMPs计数：使用长托宁各组均低于CPL组，长托宁1.0 mg/kg和2.0 mg/kg（两剂量组比较差异无统计学意义）低于0.1 mg/kg和0.5 mg/kg（两剂量比较差异无统计学意义）；sham组LPS含量低于所有其他组（P＜0.05），而其他各组间LPS含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 大鼠72 h生存率[n（%），n=20]

表2 血浆TNF-α、IL-6、内毒素含量和外周血内皮细胞及其微粒计数（±s，n=10）

表2 血浆TNF-α、IL-6、内毒素含量和外周血内皮细胞及其微粒计数（±s，n=10）

注：与 CPL 组比较，*P ＜ 0.05；与 PHC0.1组比较，﹟P ＜ 0.05；与 PHC0.5组比较，▼P＜0.05

组别 TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）LPS（ng/L）CECs（/105PBMCs）EMPs（个/mL）sham组CPL组PHC0.1组PHC0.5组PHC1.0组PHC2.0组68±30 291±127 255±120*260±102*156±95*﹟▼129±116*﹟▼34±18 181±102 167±103*170±98*104±73*﹟▼78±75*﹟▼84±37 280±71 267±83*290±64 300±39 258±77 0.84±0.47 48.02±11.07 37.12±13.36*29.70±14.52*20.92±9.08*﹟▼18.83±10.19*﹟▼24±17 278±95 167±93*190±40*103±59*﹟▼108±78*﹟▼

3 讨论

脓毒血症是宿主对感染的一种全身性反应，也是一种死亡率极高的疾病阶段。脓毒血症时全身内皮细胞（VECs）被激活，对整个机体而言，内皮细胞功能障碍表现为止血系统失衡、细胞黏附增加[2]、白细胞募集、血管舒缩功能改变和丧失屏障作用。CECs及EMPs作为脓毒血症中VECs功能障碍是重要的细胞标志物。

盐酸戊乙奎醚是新型选择性抗胆碱药物，对中枢和周围神经均具有很强的抗胆碱作用，作用全面，持续时间长，高度选择性M1、M3受体拮抗作用，而对M2受体无明显作用，大量研究显示在缺血再灌注损伤和细胞功能保护上发挥作用，在围术期器官功能保护方面研究较多；改善微循环，拮抗炎症因子及炎症介质，保护细胞膜及溶酶体膜，降低毛细血管通透性等，并在减轻局部炎症反应，缓解心肌细胞氧化应激反应方面发挥作用。

本实验表明，盐酸戊乙奎醚能够有效减轻外周血CECs和EMPs计数。脓毒血症时机体促、抗炎介质产生及释放失衡，早期以促炎介质的释放为主，包括TNF-α、IL-1、IL-6和ICAM-1等[3]。大量的实验研究一致认为[4]，TNF-α是脓毒血症发病的重要介质，是脓毒性休克时最早释放且起关键作用的介质，它启动脓毒血症的炎性反应，并在发展过程中起放大作用，即所谓的免疫炎症的 “瀑布反应”。脓毒血症时，TNF-α和干扰素可诱导整联蛋白α导致内皮细胞脱落[5]。同时，内皮细胞合成分泌的白细胞趋化因子及表达的黏附因子增加，促进白细胞与内皮细胞黏附，而中性粒细胞可通过释放蛋白酶来降解黏连蛋白促进内皮细胞脱落[6]。本实验使用PHC后血浆TNF-α、IL-6和LPS水平均降低，由此笔者认为PHC通过抑制TNF-α等炎症因子释放，从而减少外周血CECs及EMPs计数，使内皮细胞受到保护。具体机制需要进一步研究。

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