Ⅱ型糖尿病肾病模型db/db小鼠血浆的代谢组学研究

孙立业 毛 璇 张冬娟 孙 博 管又飞 颜贤忠

1.军医进修学院，北京 100853；2.国家生物医学分析中心，北京 100850；3.北京大学医学部生理学与病理生理学系，北京 100083

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，同时也是导致终末期肾损害的重要因素[1]。目前，临床上对糖尿病肾病的诊断主要依赖于对尿微量白蛋白排泄率（UAER）的检测，但因为尿微量白蛋白的含量会受肥胖、胰岛素抵抗等诸多因素影响而存在着局限性[2]。糖尿病肾病的发病机制目前尚无统一定论，当前研究主要集中在糖代谢、脂代谢、氧化应激[3-5]等方面。代谢组学作为一种全面研究生物机体或组织细胞动态代谢的技术手段，近年来在疾病的诊断、标志物筛查以及发病机理的研究等方面已有广泛的应用[6-8]。本文采用基于核磁共振（NMR）的代谢组学技术对db/db糖尿病肾病小鼠血浆中内源性小分子代谢物进行分析，结合模式识别技术确定糖尿病肾病小鼠机体由于病理刺激而产生的代谢紊乱，进行潜在代谢标志物分析，并对其病理机制进行探讨，为临床的诊疗提供可能的新思路，新方法。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

糖尿病肾病模型db/db小鼠（试验组）6只，体重（53.9±2.1）g；db/m 小鼠（对照组）6 只，体重（26.8±2.3）g。所有小鼠均为雄性，周龄为14～16周，由北京大学医学部提供。动物饲养房12 h昼夜交替，温度为25～27℃，动物自由摄食饮水。

1.2 试剂和仪器

重水（D2O）购自美国 Norell公司；2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）购自加拿大默克公司；戊巴比妥钠和肝素钠购于国药集团化学试剂有限公司。VarianUNITYINOVA 600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪，购自美国瓦里安公司；Eppendorf 5810R离心机，购自德国Eppendorf公司。

1.3 血浆样本制备和处理

对小鼠进行解剖，各组小鼠用戊巴比妥钠（2%，2.5 mL/kg）麻醉后，于心脏动脉取血，使用肝素钠抗凝，3 500 r/min离心15 min后得到血浆，取250 μL血浆，13 000 r/min离心10 min，取上清液 200 μL，加入 100 μL 的 TSP 重水溶液（1 mg/mL）和300 μL D2O，涡旋混匀后加入至5 mm核磁管中，用于核磁共振检测。

1.4 核磁共振数据采集与预处理

于27℃下，使用VarianUNITYINOVA 600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪采集血浆核磁共振一维1H谱，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列抑制由蛋白和脂蛋白等物质产生的宽峰，检测血浆中的小分子代谢物，实验主要参数如下：谱宽8 000 Hz、弛豫延迟时间2 s、采样点数64 K、累加次数64次，采用预饱方式抑制水峰信号。FID信号经过傅立叶变换转换为一维1H NMR谱图，调整相位并进行基线校正后以乳酸双峰左侧峰定标，化学位移定为δ1.33。将δ4.4～0.4范围内的谱图按照每段δ0.002进行分段积分，再将积分按每张谱的总积分强度为10 000进行归一化，所得数据输出并转换到Excel文件后保存。

1.5 数据分析

应用 MATLAB R2008a（The MathWorks，Inc.，Natick，MA，USA）软件对积分数据进行对齐，采用多元统计分析软件SIMCA-P12.0+（Umetrics AB，Umea，Sweden）对对齐后的数据进行模式识别分析及皮尔森（Pearson）相关性分析，数据在进行单位方差（UV scaling）预处理之后采用正交偏最小二乘判别法（OPLS-DA）进行分析[9]，采用七折交叉验证法[10-11]（seven-fold cross-validation）来验证模型的有效性，用R2X和R2Y的值表示模型拟合情况，Q2值表示模型的预测能力。最后利用MATLAB R2008a软件做出相关系数图，更直观也更客观的发现组间差异代谢物。

2 结果

2.1 1H核磁共振谱图

图1显示的为两组小鼠血浆的核磁共振1H谱，其中A为对照组db/m小鼠，B为试验组db/db小鼠。主要代谢物已在图中进行了标注，从谱图中可以明显观察到db/db小鼠血浆中葡萄糖显著升高。

图1 db/m小鼠（A）与db/db小鼠（B）血浆1H核磁共振谱图

2.2 多元统计分析

为了更准确客观地分析两组间的差异代谢物，笔者采用了OPLS-DA的方法对数据进行了多元统计分析，并用交叉验证的方法对模型的预测能力进行评估（R2X=0.452，R2Y=0.992，Q2=0.879）。利用MATLAB软件做相关系数图，相关系数的临界值相当于显著性水平P=0.05，查阅相关系数r临界值表确定临界值为0.755，即|r|＞0.755的积分段所代表的代谢物在两组间有差异。图2B中颜色越接近红色，代表此信号对组间区分贡献越大，方向则表示含量的增加与减少。从图2A中可以观察到两组小鼠可以被明显区分，图2B则显示了引起组间差异的代谢物，与对照组db/m小鼠相比，db/db小鼠血浆中葡萄糖和氧化三甲胺（TMAO）的含量升高，脂蛋白、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、赖氨酸、乙酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、柠檬酸、肌酸、肌酐、甘油磷酸胆碱、磷酸胆碱、甘油的含量则下降。见表1。

图2 db/db（▲）及db/m（■）小鼠血浆核磁共振1H谱的 OPLS-DA结果

3 讨论

糖尿病肾病是导致终末期肾脏疾病的主要原因，也是糖尿病主要的死亡原因之一，因此，对于糖尿病肾病的早发现早治疗是至关重要的。目前，临床上对糖尿病的诊断主要依靠UAER方法，但这是一个不可逆的过程，当患者出现UAER升高时往往已经伴随心血管并发症及其他肾脏疾病，错过了最佳治疗时机。笔者利用基于核磁共振的代谢组学技术较全面的对样本中各类代谢物种类及含量的变化特点进行分析，寻找出主要的差异代谢物，对于辅助临床早期诊断是有重要意义的。

本文的研究结果显示，糖尿病肾病小鼠血浆内多种代谢物含量发生变化，多条代谢通路受到影响。试验组小鼠血浆中的柠檬酸含量降低，提示三羧酸循环可能受阻，这一结果在zuker大鼠[12]和核受体PPAR-缺失小鼠[13]中已有发现。db/db小鼠血浆中多种氨基酸含量发生变化，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸，说明糖尿病肾病小鼠体内存在氨基酸代谢异常，可能是由于肾小管的重吸收能力下降，导致大量氨基酸流失。其中甘氨酸作为抗氧化剂，可以延缓氧自由基对肾脏的损害，通过调节肾脏抗氧化酶、Na+-K+-三磷酸腺苷酶、脂质过氧化产物丙二醛和一氧化氮等物质的水平来保护肾脏[14]。而db/db小鼠血浆中甘氨酸含量明显减少，说明肾脏已受到损伤。

TMAO一般作为肾小管受损的标志物[15]，在本实验中试验组小鼠血浆内TMAO含量显著升高，提示着肾脏出现损伤，这一变化在db/db小鼠肾组织中同样有所体现[16]。肌酸、肌酐含量的降低可能是由于发生糖尿病肾病时，由于高血压血管紧张蛋白酶代谢紊乱而引起了肾小球滤过速率改变，进而造成肾皮层血流改变[17]。血浆中乙酸盐含量降低，与Salek等[18]报道一致。磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱含量降低与Chen等利用高分辨魔角旋转技术检测的8周龄db/db小鼠肝脏内的变化一致[19]。磷酸胆碱是属于构成细胞膜的主要成分，试验组小鼠血浆中含量的降低也提示着肾损伤。用代谢组学手段对血浆中小分子代谢物进行分析为进一步研究糖尿病肾病提供了更全面的信息。

表1 db/db小鼠与db/m小鼠血浆中主要差异代谢物及谱峰归属

本文采用用基于核磁共振的代谢组学方法对db/db糖尿病肾病模型小鼠的血浆进行了研究。结果显示，与对照组db/m小鼠相比，试验组db/db小鼠血浆内多种代谢物含量发生了变化，体现在一些已知的肾损伤的标志物TMAO、肌酸等，同时发现亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸等氨基酸含量降低，提示糖尿病肾病出现时，由于肾损伤而出现的肾小管重吸收能力下降，会导致氨基酸的流失，这些氨基酸将可能作为新的潜在代谢标志物。除此之外，糖尿病肾病小鼠可能还存在着三羧酸循环受阻，即能量代谢紊乱。以上结果表明，代谢组学技术能够更全面的反映生物体的代谢变化，帮助人们更好地了解生物体中各种复杂的代谢通路，这有可能成为一种辅助糖尿病肾病临床诊断以及病理机制探讨的重要手段。

[1]Afifi A，El SM，El Sharkawy M，et al.Diabetic nephropathy as a cause ofend-stagerenaldiseaseinEgypt：asix-yearstudy[J].EastMediterr Health J，2004，10（4-5）：620-626.

[2]Weir MR.Microalbuminuria and cardiovascular disease[J].Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（3）：581-590.

[3]Balakumar P，Arora MK，Singh M.Emerging role of PPAR ligands in the management of diabetic nephropathy[J].Pharmacol Res，2009，60（3）：170-173.

[4]Oberg BP，Mc Menamin E，Lucas FL，et al.Increased prevalence of oxidant stress and inflammation in patients with moderate to severe chronic kidney disease[J].Kidney Int，2004，65（3）：1009-1016.

[5]Chen YJ，Quilley J.Fenofibrate treatment of diabetic rats reduces nitrosative stress，renal cyclooxygenase-2 expression，and enhanced renal prostaglandin release[J].J Pharmacol Exp Ther，2008，324（2）：658-663.

[6]Hodavance MS，Ralston SL，Pelczer I.Beyond blood sugar：the potential of NMR-based metabonomics for type 2 human diabetes，and the horse as a possible model[J].Anal Bioanal Chem，2007，387（2）：533-537.

[7]Odunsi K，Wollman RM，Ambrosone CB，et al.Detection of epithelial ovarian cancer using 1H-NMR-based metabonomics[J].Int J Cancer，2005，113（5）：782-788.

[8]Hwang GS，Yang JY，Ryudo H，et al.Metabolic profiling of kidney and urine in rats with lithium-induced nephrogenic diabetes insipidus by（1）H-NMR-based metabonomics [J].Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（2）：F461-470.

[9]Cloarec O，Dumas ME，Trygg J，et al.Evaluation of the orthogonal projection on latent structure model limitations caused by chemical shift variability and improved visualization of biomarker changes in 1H NMR spectroscopic metabonomic studies[J].Anal Chem，2005，77（2）：517-526.

[10]Clayton TA，Lindon JC，Cloarec O，et al.Pharmaco-metabonomic phenotyping and personalized drug treatment[J].Nature， 2006，440（7087）：1073-1077.

[11]Slupsky CM，Rankin KN，Wagner J，et al.Investigations of the effects of gender，diurnal variation，and age in human urinary metabolomic profiles[J].Anal Chem，2007，79（18）：6995-7004.

[12]Williams R，Lenz EM，Wilson AJ，et al.A multi-analytical platform approach to the metabonomic analysis of plasma from normal and Zucker（fa/fa）obese rats[J].Mol Biosyst，2006，2（3-4）：174-183.

[13]Atherton HJ，Bailey NJ，Zhang W，et al.A combined 1H-NMR spectroscopy-and mass spectrometry-based metabolomic study of the PPAR-alpha null mutant mouse defines profound systemic changes in metabolism linked to the metabolic syndrome [J].Physiol Genomics，2006，27（2）：178-186.

[14]Zakaria FA.Effect of oxygen derived free radicals and glycine on sodium-potassium adenosine triphosphatase in the basolateral membrane of the kidney in ischemia-reperfusion[J].Saudi Med J，2002，23（11）：1380-1385.

[15]Serkova N，Fuller TF，Klawitter J，et al.H-NMR-based metabolic signatures of mild and severe ischemia/reperfusion injury in rat kidney transplants[J].Kidney Int，2005，67（3）：1142-1151.

[16]毛璇，张冬娟，管又飞，等.Ⅱ型糖尿病肾病小鼠肾水提物代谢组学研究[J].波谱学杂志，2010，27（4）：532-539.

[17]Gartland KP，Bonner FW，Timbrell JA，et al.Biochemical characterisation of para-aminophenol-induced nephrotoxic lesions in the F344 rat[J].Arch Toxicol，1989，63（2）：97-106.

[18]Salek RM，Maguire ML，Bentley E，et al.A metabolomic comparison of urinary changes in type 2 diabetes in mouse，rat，and human[J].Physiol Genomics，2007，29（2）：99-108.

[19]Xu J，Zhang J，Cai S，et al.Metabonomics studies of intact hepatic and renal cortical tissues from diabetic db/db mice using high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy[J].Anal Bioanal Chem，2009，393（6-7）：1657-1668.