补泻不同配伍补阴方对衰老大鼠三磷酸腺苷酶及Bcl-2和Bax表达的影响

孙琳林 丁良菊 任岩海 刘伦翠 卢 林

1.牡丹江医学院红旗医院中西医结合科，黑龙江牡丹江 157011；2.牡丹江医学院红旗医院脑外科，黑龙江牡丹江 157011

随着世界性人口老龄化问题的日益突显，抗衰老研究已成为医学研究中的热点之一。左归丸与六味地黄丸均是滋补肾阴的经典名方，现代研究发现两方均有延缓衰老的药理作用。左归丸是张景岳根据六味地黄丸加减化裁而成，前者纯甘壮水，补而不泻，后者以补为主，补泻兼顾。本研究在前期相关实验的基础上，观察了左归丸、六味地黄丸及两方共有“三补”药物组对D-半乳糖（D-gal）致衰老模型大鼠三磷酸腺苷酶（ATPase）及凋亡因子Bcl-2和Bax表达的影响，探讨了两补阴方对衰老模型大鼠的细胞钙稳态、膜稳定性和细胞凋亡的调节作用，从补泻不同配伍方式的角度对两方抗衰作用进行分析和比较。

1 材料与方法

1.1 用药及制备

左归丸（熟地 24 g、山药 12 g、山萸肉 12 g、枸杞 12 g、牛膝9 g、菟丝子12 g、龟板胶12 g和鹿角胶 12 g）、六味地黄丸（熟地 24 g、山药 12 g、山萸肉 12 g、茯苓 9 g、牡丹皮 9 g和泽泻9 g）及“三补”药物组（熟地24 g、山药12 g和山萸肉12 g）。中药饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医院，左归丸煎制后浓度为6.3 g/mL，六味地黄丸煎制后浓度为4.5 g/mL，“三补”药物组煎制后浓度为2.88 g/mL，4℃冷藏保存。

1.2 动物及分组

取 Wistar大鼠 60 只，雌雄各半，体重（300±20）g，体重区域化后随机分为正常组、模型组、六味组、三补组和左归组，每组12只。

1.3 造模及给药

选用D-半乳糖致亚急性衰老模型[1]。将D-gal 5 000 mg溶于生理盐水500 mL中，配成10 mg/mL浓度的溶液，按125 mg/（kg·d）剂量给大鼠腹腔注射，正常组注射等体积生理盐水，造模周期为8周。左归组、六味组和三补组造模开始的同时按10 mL/kg每日上午分别给予相应治疗药物，正常组和模型组给予生理盐水，每日1次。左归组、六味组和三补组的模型大鼠每日灌服剂量分别为31.5、22.5和14.4 g/kg，给药周期为8周。8周后各组大鼠取肝、脑组织进行组织匀浆和固定，脑组织固定后剥离海马区，按要求保存，待测。

1.4 指标及检测

观察指标包括：肝、脑组织中的ATPase活力和脑海马区的Bcl-2和Bax蛋白表达。测定ATPase试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，Bcl-2和Bax免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，所有指标检测均按照实际说明进行，免疫组化以酶标抗体法染色DAB显色剂显色后，采用Motic Med 6.0彩色病理图像分析系统进行分析和计数。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组对细胞膜三磷酸腺苷酶活力的作用

实验动物ATPase活力在模型组明显低于正常组，差异有高度统计学意义（P<0.01）；各给药组中，六味组和三补组对肝、脑细胞膜的Na+-K+-ATPase和肝细胞膜的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05），但其对脑细胞膜中的Ca2+-Mg2+-ATPase活力的提升作用与模型组比差异无统计学意义 （P>0.05），左归组对肝、脑细胞膜的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活力提升作用模型组差异均有统计学意义（P<0.01或P<0.05），三给药组之间差异无统计学意义。见表1、2。

表1 各组对肝细胞膜三磷酸腺苷酶活性的影响作用（±s）

表1 各组对肝细胞膜三磷酸腺苷酶活性的影响作用（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 只数 Na+-K+-ATPase（U/mg prot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mg prot）正常组模型组六味组三补组左归组12 12 12 12 12 2.53±0.49**0.78±0.36 1.62±0.57**1.58±0.52**1.65±0.54**2.02±0.73**0.92±0.47 2.26±1.00**1.50±0.56*1.61±0.60*

2.2 各组对脑海马区Bcl-2和Bax的作用

根据表3可以看出，模型组动物脑海马区的Bax蛋白表达比正常组显著升高，Bcl-2显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；三个给药组动物的脑海马区Bcl-2表达显著上调，Bax表达显著下调，相较于模型组差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（图1～10），各给药组之间差异无统计学意义。

3 讨论

D-gal 造成亚急性衰老模型的机制在于其引起的糖代谢紊乱能使生物体产生大量自由基，大量的自由基又能导致生物体出现多种由氧自由基介导的损伤效应，这些损伤累积到一定程度即引起亚急性衰老的发生。在这一过程中，Ca2+-Mg2+-ATPase的巯基蛋白基团可被氧自由基氧化，使其活性下降；同时脂质过氧化的发生还能引起细胞膜的流动性的改变，从而对酶的集聚造成影响[2]。自由基引起的氧化损伤还包括细胞毒反应，这种损伤不可逆，会导致细胞凋亡的发生。据报道自由基尤其是活性氧自由基（ROS）是调节细胞凋亡的重要因素之一，如砷剂诱导细胞凋亡就是通过提高细胞中ROS的含量来实现的[3]。ATPase是细胞膜上负责细胞内外离子平衡的一种膜酶，它能将细胞内的钙泵到细胞外，从而使细胞持续处于细胞内钙低浓度而胞外高浓度的状态，我们称之为“钙稳态”。正常情况下，ATPase会随着年龄的增加而活性下降，引起神经细胞内游离钙浓度增加，出现钙稳态的失调，细胞内钙超载，加速细胞的衰老[4]。因此，提高ATPase活性，促进维持细胞的钙稳态，可以在一定程度上延缓衰老。细胞凋亡可以由包括自由基在内的多种因素诱发产生，Bcl-2的过度表达可有效阻止细胞凋亡的发生。Bax与之相反，其主要作用是加速细胞凋亡。Bax在凋亡发生过程中不但能和Bcl-2形成异源二聚体（Bcl-2-Bax，heterodimer）而起到抑制凋亡的作用，还能自身形成同源二聚体（Bax-Bax，homodimer）而诱导凋亡[5]。

表2 各组对脑细胞膜三磷酸腺苷酶活性的影响作用（±s）

表2 各组对脑细胞膜三磷酸腺苷酶活性的影响作用（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 只数 Na+-K+-ATPase（U/mgprot）Ca2+-Mg2+-ATPase（U/mgprot）正常组模型组六味组三补组左归组12 12 12 12 12 11.7±3.04**2.59±1.68 4.38±2.09*5.54±2.86**7.01±3.03**7.29±2.61**2.72±1.30 3.04±1.45 3.16±1.89 4.43±1.37*

表3 各组对衰老大鼠脑海马区Bcl-2和Bax表达的影响（±s）

表3 各组对衰老大鼠脑海马区Bcl-2和Bax表达的影响（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别 只数 Bcl-2 Bax正常组模型组六味组三补组左归组12 12 12 12 12 165.1±2.26*69.4±3.43 185.7±5.02**170.2±3.07*173.4±3.13*168.1±3.62**185.9±4.90 173.9±4.05**179.3±3.09**173.1±3.12**

中医学认为衰老的内因在于肾中阴精的亏损，如《素问·阴阳应象大论》中记载：“年四十，而阴气自半也，起居衰矣”，朱丹溪在《养老论》一文中亦提出：“人身之阴，难成易亏，六七十后，阴不足以配阳，孤阳几欲飞越”，可见补肾填精可以延缓衰老。现代大量的药理研究已发现，具有补肾填精作用的中药复方可以通过影响细胞周期而发挥减缓细胞衰老的作用[6]。左归丸与六味地黄丸均有滋肾阴、补肾精的作用，是公认的抗衰古方，从配伍上看，补肾填精的“三补”是两方共有的并且在方中起主要治疗作用的部分。本实验结果发现，D-半乳糖可以使ATPase活性降低，Bcl-2和Bax蛋白表达明显上调，给予三组中药干预后ATPase活性提高、抑制凋亡因子Bcl-2应激性的表达上调、加速凋亡因子Bax出现表达下调，说明左归丸与六味地黄丸的抗衰老作用可能与促进维持细胞膜的稳定性和钙稳态状态以及抑制细胞凋亡有关，两方共有的“三补”药物组亦具有相同的药理作用。两补阴方尽管存在补泻配伍方法上的不同，但在本研究中未出现显著性药理作用差异，提示“三补”在两方中发挥了优势性作用。

[1]徐叔云，卞如濂.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2006：1464-1466.

[2]张伟，张艳淑，姚林，等.Oncolyn对衰老小鼠脑组织中ATP酶活性和神经生长因子的表达的影响[J].卫生研究，2007，36（2）：164-166.

[3]Nystrom T.The free-radical hypothesis of aginggoes prokaryotic[J].Cell Mol Life Sci，2003，60（7）：1333-1341.

[4]Guoyuan Y，Chen Sylvia F，Kinouchi H，et al.Edema cation content and ATPase activity after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1992，23（9）：1331-1336.

[5]Guan QH，Pei DS，Xu TL，et al.Brain ischem in reperfusion-induced expression of DP5 and interaction with Bcl-2，thus freeing Bax from Bcl-2/Bax dimmers are mediated by c-Jun N-terminal kinase（JNK）pathway[J].Neurosci Lett，2006，393：226-236.

[6]胡兵，安红梅，史云峰，等.补肾填精复方对WI38细胞周期及相关基因表达的影响[J].成都中医药大学学报，2007，30（2）：35-38.