谷氨酰胺强化的早期肠内营养对严重烫伤大鼠肠黏膜结构及细胞凋亡的影响

赵永华 邱 方 孟 伟

河北省廊坊市人民医院重症医学科，河北廊坊 065000

严重烧伤后的病理生理反应几乎涉及全身所有组织和器官，烧伤不仅使局部组织受到破坏，还存在着广泛的组织缺血缺氧性损害，使各种器官不同程度受损，而烧伤后胃肠道损伤也是研究者关注的热点。近年来，随着对凋亡研究的不断深入，Zhang等[1]认为，细胞凋亡在维持肠黏膜上皮细胞稳态中起重要作用。谷氨酰胺（Gln）是条件必须氨基酸，对人体非常重要，参与多种代谢必需物质的合成，并为肠黏膜和其他增生活跃的细胞（如免疫细胞）提供主要能量[2-3]。严重创伤、烧伤后Gln被迅速消耗，机体内Gln减少[4]，而Gln缺乏将会引起肠黏膜细胞凋亡增加和增殖减少，从而导致肠黏膜萎缩，肠屏障功能受损，甚至因此引起全身炎症应答综合征（SIRS）和多器官功能衰竭综合征（MOF）[5]。本研究选用大鼠25%总体表面积（TBSA）Ⅲ度烧伤模型，经给予Gln强化的肠内营养来观察其对肠黏膜细胞结构和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康成年Wistar大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）50只，雌雄不限，体重280～300 g。

1.2 试剂

肠内营养剂能全力（Nutricia公司），谷氨酰胺（重庆药友制药），DAO检测试剂及标准品（Sigma公司），TUNEL检测试剂盒（Roche公司）。

1.3 方法

1.3.1 烫伤模型的制作 健康成年Wistar大鼠适应性喂养1周后，随机分为两组，即肠内营养组（EN组）和肠内营养加谷氨酰胺补给组 （EN+Gln组），将两组大鼠均制成烫伤模型，每组20只；另取10只作为伤前对照，制成假烫模型（假烫伤组），将其测得数据作为伤前参考值。大鼠烫伤前禁食12 h，予腹腔注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，称其体重后根据计算公式 S（cm2）=9.1×W（g）2/3（S 为体表面积，W 为体重） 确定 TBSA的25%面积。背部电推剃毛，将两组动物备皮部位置于90℃水中7 s，制备25%TBSA的烫伤模型（经病理学的检查证实）。伤后给予腹腔注射等渗盐水50 mL/kg抗休克。将大鼠放入限制笼内饲养。

1.3.2 营养液的配制与供给 给予同等热量的肠内营养物，EN组给予肠内营养剂能全力，EN+Gln组在此基础上添加Gln 0.3 g/（d·kg），伤后 4 h开始灌喂营养液。每日总热量按文献[6]报道的731.5 kJ/kg给予，每天计划量分3～5次喂完，不限饮水。

1.3.3 标本采集 于烫伤后24、72 h，EN组和EN+Gln组分别各取10只大鼠，氯胺酮麻醉后固定于手术台上，在无菌操作条件下剖开腹腔，用去热原空针抽取门静脉血2 mL放入加入肝素的试管中，4℃3 000 rpm离心12 min，吸取上清液各1 mL，-70℃保存，待用。立即取距回盲部5 cm处回肠5 cm，用等渗盐水（4℃）冲净肠内容物及黏液，取其中4 cm用体积分数为10%的甲醛固定后制成病理标本；另外1 cm置入3%的戊二醛溶液（4℃）固定拟做透射电镜检查。

1.3.4 检测指标和方法 ①血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性测定：DAO测定参见文献[7]的方法。②小肠细胞凋亡的观察：常规石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡入水，梯度乙醇水化，按照美国罗氏公司公司的TUNEL检测试剂盒说明进行操作。 光镜下计算凋亡指数（apoptotic index，AI），AI计算方法：计算每100个上皮细胞中凋亡细胞个数，每张切片各选4个视野，求其平均值。AI=凋亡细胞数×100%。③常规石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片，采用 HPIAS-1000彩色病理图像分析系统观测HE染色切片。④经戊二醛、锇酸双固定，乙醇系列脱水，环氧树脂包埋剂浸透、包埋，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅电子染色，在JEM-100CX透射电镜观察肠黏膜上皮细胞超微结构。

1.4 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二胺氧化酶活性的测定情况

烫伤后EN组和EN+Gln组大鼠血浆DAO活性较假烫伤组均升高（P<0.01）；EN+Gln组在 24、72h时血浆 DAO 活性明显低于EN组（P<0.01），说明补充Gln的肠内营养能降低烫伤大鼠DAO活性。见表1。

表1 烫伤后各组大鼠DAO活性测定（±s，U/mL）

表1 烫伤后各组大鼠DAO活性测定（±s，U/mL）

注：与假烫伤组比较，aP<0.01；与EN组比较，bP<0.01

组别 只数 烫伤后时间（h）24 72假烫伤组EN组EN+Gln组10 20 20 0.61±0.12 2.01±0.12a 1.07±0.15ab 0.61±0.12 1.69±0.08a 0.87±0.10ab

2.2 小肠上皮细胞凋亡情况

烫伤后各组大鼠的AI均较假烫伤组高 （P<0.01），EN组和EN+Gln组72 h AI值均较24 h时下降，与EN组相比EN+Gln 组下降更明显（P<0.01）。 见表 2，图 1、2。

表2 烫伤后各组小肠上皮细胞凋亡情况（±s）

表2 烫伤后各组小肠上皮细胞凋亡情况（±s）

注：与假烫伤组比较，aP<0.01，bP<0.01；与EN组比较，cP<0.01

组别 只数 烫伤后时间（h）24 72假烫伤组EN组EN+Gln组20 20 10 4.40±0.13 15.15±0.26a 10.93±0.19bc 4.40±0.13 11.99±0.21a 8.20±0.74bc

2.3 小肠形态学情况

假烫伤组小肠黏膜绒毛呈指状突起，绒毛较长，中间有中央乳糜管，表面覆以柱状上皮细胞，其肠腔面可见浓集的刷状缘。EN组伤后24 h肠黏膜明显萎缩，绒毛融合、坏死、脱落，肠腺消失，伴有大量淋巴细胞浸润。EN+Gln组烫伤后24 h肠黏膜轻度萎缩，绒毛排列较规则，肠黏膜固有层完整，杯状细胞增多，有少量淋巴细胞浸润。EN+Gln组与EN组相比，肠绒毛高度及肠黏膜厚度均有所增加。烫伤后72 h，EN组与EN+Gln组肠黏膜损伤较24 h时有所恢复，但仍未恢复到正常，与EN组比较，EN+Gln组肠黏膜恢复明显（P<0.05）。见表 3，图 3、4。

表3 大鼠肠黏膜形态学测量情况（±s，μm）

表3 大鼠肠黏膜形态学测量情况（±s，μm）

注：与假烫伤组比较，*P<0.01，#P<0.05；与同时间点 EN组比较，※P<0.05，▲P<0.01

组别 时间（h） 只数 肠绒毛高度 肠粘膜厚度假烫伤组EN组EN+Gln组24 72 24 72 10 20 20 20 20 268.5±7.3 189.3±8.1*196.2±8.4*197.1±9.7*※212.6±8.7*▲404.9±10.1 365.1±6.1*380.0±9.8*370.9±6.3*393.0±6.7#▲

2.4 肠黏膜上皮细胞超微结构变化

烫伤后24 h，EN组肠上皮细胞局部微绒毛肿胀，桥粒结构张力微丝稀疏，核固缩，核异染色质呈块状边集，有些线粒体空化、嵴断裂或缺失，内质网扩张。EN+Gln组肠上皮细胞微绒毛、细胞连接、线粒体及内质网结构和核常染色质分布基本正常。伤后72 h，EN+Gln组肠上皮细胞微绒毛和细胞连接局部结构轻微异常（图5），EN组肠上皮细胞微绒毛、细胞连接结构局部仍表现异常（图6）。

3 讨论

胃肠道黏膜是血流最丰富的部位，需要足够的血流保证其正常的功能，同时其是缺血缺氧最敏感的部位，一旦出现血流灌注不足，胃肠道最易受累，肠屏障功能障碍也最先发生，而烧伤后由于大量液体外渗，导致血容量不足而休克，造成体内的血液从新分布，优先供应心、脑、肾等重要器官，从而造成肠黏膜缺血缺氧，以及后期缺血再灌注和大量细胞因子的过度释放，造成肠黏膜的损伤，从而影响到肠屏障的功能。

DAO是肠黏膜细胞的标志酶，存在于哺乳动物小肠黏膜绒毛上层，其他组织和细胞中几乎不存在DAO。生理状况下，血浆中DAO活性很低，在肠黏膜受损时，肠黏膜上皮细胞受损坏死后DAO释放增加，进入淋巴管和血流，使血中DAO的含量升高而肠黏膜活性下降，其是反映小肠黏膜结构和功能较理想的指标[8]。在本实验中，严重烫伤后EN组和EN+Gln组DAO活性均比假烫伤组增高，烫伤72 h后两组DAO活性均呈下降趋势，但EN+Gln组下降更明显，说明Gln能使严重烫伤后血浆DAO活性下降，减少肠黏膜的损伤。Peng等[9]的研究表明，在应用Gln后，治疗组的血浆DAO活性降低，但14 d后仍高于正常水平，说明应用Gln虽减少了肠黏膜的损伤，但是不能治愈该损伤。本实验虽作用时间较短，但实验结果与Peng等[9]相似。

细胞凋亡时钙镁依赖性核酸内切酶被激活，使DNA发生断裂，产生3'-OH末端，故可用末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）介导将标记的dUTP加到DNA分子有凹缺的3'-OH末端（TUNEL），从而检测凋亡细胞，此方法是目前研究细胞凋亡的最常用的技术，具有高敏感性和特异性且能够识别凋亡早期的细胞。本实验采用TUNEL法检测肠黏膜细胞凋亡发现，烫伤后大鼠的肠黏膜AI值比假烫伤组高，说明烫伤后大鼠的肠黏膜凋亡数量增加，小肠的萎缩与之有关；与EN组各时间点相比，EN+Gln组AI均降低，说明Gln能促进减少细胞凋亡。Kenji等[10]通过实验证实，在内毒素血症的大鼠中应用Gln能增加Bcl-2 mRNA表达并减少caspase-3的表达，说明Gln能抑制肠黏膜的细胞凋亡。Kana等[11]发现，出血性休克的大鼠上应用Gln能够保护肠黏膜细胞，抑制细胞凋亡。Gln抑制细胞凋亡的可能机制为：①Gln通过核酸合成的途径抑制细胞因子诱导的细胞凋亡[12]；②Gln增强凋亡抑制基因Bcl-2的表达；③Gln增加热休克蛋白（Hsp70）的水平和提升谷胱甘肽（GSH）含量，两者均具有抑制细胞凋亡的作用[13]。

有研究表明，大鼠在严重的烫伤后肠绒毛的高度和肠黏膜的厚度均较正常大鼠低[14]。在本实验中，烫伤后大鼠的肠黏膜厚度和肠绒毛的高度均低于正常组，EN+Gln组和EN组都有恢复于正常的趋势，但在相同时间点EN+Gln组较EN组更接近正常值。Lü等[15]实验证实，给烧伤大鼠应用Gln，对受损肠黏膜的血流、肠黏膜厚度和肠绒毛高度均有逆转作用，说明Gln可减轻烧伤后肠黏膜受损程度，促进肠黏膜修复，与本实验结果一致。

综上所述，本研究证实，大鼠在严重烫伤后肠黏膜受到损伤，Gln强化的早期肠内营养能减少严重烫伤大鼠的肠黏膜上皮细胞的凋亡，促进肠黏膜恢复，更好的维护肠黏膜屏障的作用，但是Gln保护烫伤后肠黏膜受损的具体机制尚不十分清楚，抑制细胞凋亡可能只是其作用机制之一。深入探讨其机制并采取相应的治疗策略，将有助于控制严重烫伤后全身炎症反应综合征（SIRS）及多器官障碍综合征（MODS）的发生，对降低并发症、改善治疗效果都具有重要的临床意义。

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