NS-398对人胃癌细胞系SGC-7901增殖、凋亡和COX-2表达的影响

余 涛，李良庆，王家兴，于锡阳，栗大伟

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科一区，福建福州350004)

胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，尤其是在东亚和东南亚，包括中国在内［1］。每年我国因胃癌死亡的人数占各种恶性肿瘤之首，传统手术及术后化疗对进展期胃癌的治疗仍不理想，近年来，随着对肿瘤分子生物学研究的不断深入，针对肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期等的研究逐渐成为抗肿瘤治疗的重点和热点。环氧合酶－2(cyclooxygenase-2，COX-2)作为新型肿瘤标志物，在多种人类肿瘤中过度表达，在肿瘤的进展中，COX-2参与了许多病理生理过程，包括细胞的增殖、凋亡、调节免疫和血管生成［2－3］。近年来选择性COX-2抑制剂，在抗肿瘤通路中受到国内外学者的广泛关注，本实验通过MTT、免疫组化、ELISA、流式细胞仪观察选择性COX-2抑制剂NS-398在体外对胃癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料及试剂 人胃癌SGC-7901细胞株购自南京凯基生物技术有限公司。NS-398购自美国Sigma公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司;胰蛋白酶、RMPI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;前列腺素－E2(prostaglandin E2，PGE2)酶联免疫测定试剂购自江苏碧云天生物技术研究所;Alexa Fluor 488Annxin V/PI试剂盒购自Invitrogen公司。COX-2免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SGC-7901细胞置于37℃，体积分数5%CO2恒温培养箱内培养，培养液为含体积分数10%灭活胎牛血清的RMPI-1640培养基，当细胞呈对数增殖并覆盖培养瓶瓶底80%面积时可用于传代或实验。

1.2.2 MTT法测定NS-398对SGC-7901细胞的抑制率 取对数期生长的SGC-7901细胞，制备单细胞悬液，以每孔1.0×104个细胞接种于96孔板培养24 h后。换 NS-398 浓度分别为 50、100、200 μmol·L－1的含体积分数10%胎牛血清的RMPI-1640培养基，其中设空白对照组，即未加药的培养基，每种浓度设6个复孔，分别培养 24、48、72 h后，再向每孔加 MTT(5 g·L－1)20 μL，继续培养 4 h，吸去原培养液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡 10 min;用酶标仪(波长 490 nm)测定每个孔的吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞抑制率，抑制率=(1－实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.3 免疫组化方法检测COX-2蛋白的表达 取对数生长期的SGC-7901细胞接种于含盖玻片的6孔板内，常规培养24 h后，换NS-398浓度分别为50、100、200 μmol·L－1的含体积分数 10%胎牛血清 RMPI-1640培养基并设实验空白对照组，即不含NS-398的培养基继续培养48 h，取出玻片，PBS冲洗数次，体积分数4%的多聚甲醛固定。COX-2免疫细胞化学染色，操作按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作为阴性对照组，用无NS-398干预组作为阳性对照组。判断标准:将不同浓度处理组重复40次，每张玻片置于光学显微镜下，随机计数1 000个细胞(独立高倍视野)中的阳性细胞数，用 Gatalica等［4］的半定量分析法，即对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级计分，然后根据2项乘积确定其阳性强度。将染色强度分为4级:无染色为0分，弱染色1分，中等染色2分，强染色3分，阳性细胞百分率:＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～75%为2分，＞75%为3分;然后进行组织评分(H)=染色强度计分(I)×阳性细胞百分率计分(P)，0～1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为阳性(++)，＞6分为强阳性(+++)。本研究以阳性及强阳性记为阳性数据，以阴性及弱阳性记为阴性数据。

1.2.4 ELISA法测定SGC-7901细胞释放的 PGE2将呈对数生长期的SGC-7901细胞制成单细胞悬液，以每孔1×105个的密度接种于24孔板，每孔1 mL。常规培养24 h后弃去培养液分组加药物。实验组NS-398 浓度分别为 50、100、200 μmol·L－1，对照组加培养液。培养48 h后分别收集上清，存于－20℃中备用。取上述细胞培养上清液，按ELISA试剂盒说明书进行测定PGE2。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 选对数生长期的SGC-7901细胞，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，用培养液调整细胞浓度为每孔1×105个，接种于6孔培养板，每孔1.5 mL。细胞贴壁后弃去培养液分组加药物。实验组NS-398浓度分别为50、100、200 μmol·L－1，对照组加培养液。培养 48 h 后分别收集每孔细胞，再经预冷的PBS洗3次，按Alexa Fluor 488Annxin V/PI试剂盒提供的方法依次加入结合缓冲液、Alexa Fluor 488Annxin V和PI，常温避光15～30 min后经流式细胞仪检测并读取细胞凋亡率。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 17.0处理数据。计量资料以±s表示。对符合正态分布的计量资料采用方差分析，多组间指标的比较均采用单因素方差分析，LSD-t及SNK-q检验。细胞染色结果比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NS-398对SGC-7901细胞生长抑制曲线 NS-398以时间剂量依赖性方式抑制SGC-7901细胞的生长，差异有统计学意义(P＜0.05)，不同浓度的NS-398作用24、48、72 h后细胞抑制率均逐渐上升(P＜0.05)。见表1。

表1 不同浓度NS-398在不同时间对SGC-7901细胞的抑制率 %

2.2 NS-398对SGC-7901细胞COX-2蛋白的表达COX-2免疫阳性染色在光镜下表现为胞浆和胞核呈棕黄色颗粒，阴性细胞表现为胞浆和胞核未见明显棕黄色染色颗粒。结果显示:COX-2在SGC-7901细胞的胞浆及胞核中成高表达，阳性表达率为95.03%;经50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 48 h 后的 SGC-7901细胞COX-2蛋白表达明显减弱，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);随着NS-398浓度的增加，COX-2蛋白表达呈下降趋势，且实验组间差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2、3，图1。

表2 不同浓度NS-398作用于SGC-7901细胞48 h后COX-2蛋白的表达

表3 不同浓度NS-398作用于SGC-7901细胞48 h后的COX-2蛋白表达率

2.3 NS-398作用SGC-7901细胞后PGE2的检测结果 NS-398可明显抑制PGE2的释放，且呈剂量依赖效应，0、50、100、200 μmol·L－1的 NS-398 作用 SGC-7901细胞48 h后，PGE2的释放量呈下调趋势，实验组与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，各实验组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 不同浓度的NS-398作用于SGC-7901细胞后PGE2表达

2.4 细胞凋亡率检测 0、50、100、200 μmol·L－1的NS-398作用SGC-7901细胞48 h后，SGC-7901细胞的凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着药物浓度的增加，凋亡率呈上调趋势，且各实验组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表5。

表5 不同浓度的NS-398对SGC-7901细胞凋亡的影响

3 讨论

COX-2是花生四烯酸/前列腺素代谢中的一个关键限速酶，与COX-1不同，COX-2在人体为诱导性酶，在生理状态下静息组织内不表达，而在致炎因子、损伤、生长因子、致瘤因子等作用下可诱导其迅速表达。近年来，越来越多研究［5－6］发现 COX-2在肿瘤发生、发展中产生重要作用，许多恶性肿瘤内都能检测到COX-2的高表达，如乳腺癌、肺癌、大肠癌和鼻咽癌等。研究表明，在胃癌细胞中COX-2也存在高表达，且其表达程度与胃癌预后密切相关［7］。本实验研究也证明COX-2在胃癌细胞中存在高表达，提示，COX-2可能与胃癌的发生存在相关性，研究发现COX-2的高表达不仅代表肿瘤的早期事件，且与肿瘤的浸润程度、淋巴结转移、TNM分期及患者的预后密切相关［8－9］。目前认为COX-2的致肿瘤机制包括:诱导肿瘤血管生成、抑制肿瘤凋亡、增加肿瘤发生和侵袭的能力、免疫抑制等［10－11］。

前列腺素作为第二信使，与其受体结合，可发挥多种生物学效应。如促进细胞的增殖、诱导血管的生成、刺激肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的凋亡等。COX-2的高表达增加了PGE2的合成，PGE2可抑制树突状细胞成熟，抑制CD8+T细胞的活性，抑制人白细胞抗原Ⅰ和Ⅱ的表达，从而减少机体免疫系统对突变细胞的免疫监视作用［12］，此外，PGE2可诱导Bcl-2的表达，后者参与了内源性凋亡途径(线粒体凋亡途径)，可阻止细胞色素C从线粒体向胞浆释放，而该环节位于半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应上游［13］，因此阻断了内源性凋亡途径，导致细胞在增殖与凋亡中失衡，从而导致肿瘤的产生。理论上可通过抑制COX-2的表达而使PGE2的产生减少，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

由于COX-2致癌途径成为了许多肿瘤发生、发展及抗凋亡重要途径，因此作者推测COX-2可能成为肿瘤靶向治疗的很好位点，这促使研究选择性COX-2抑制剂抑制肿瘤细胞生长的可能性。

本研究主要观察选择性COX-2抑制剂NS-398对SGC-7901细胞株的增殖、凋亡的影响，并初步探讨其可能的机制。MTT、流式细胞仪检测实验结果显示，NS-398对SGC-7901细胞具有明显的抑制、促凋亡作用，并呈现良好的时间和剂量双效依赖性，作者推测可能与NS-398通过对COX-2的抑制作用而活化诱导凋亡信号caspase-3活性、抑制Bcl-2的表达、提升介导凋亡的转化生长因子TGFβ2受体水平以及抑制抗凋亡关键激酶Akt活性相关。免疫组化、ELISA法检测结果显示，COX-2在SGC-7901细胞株中呈现高表达，PGE2在SGC-7901存在高释放量，这与国内外许多学者研究结果一致［14－15］，经 NS-398作用48 h后 COX-2的表达量明显减少、PGE2的释放呈下调趋势，并呈剂量依赖性，同时细胞凋亡水平上升。作者推测可能与抑制COX-2-PGE2依赖途径，抑制Bcl-2的表达，阻断内源性凋亡途径相关。因此本研究结果证实选择性COX-2抑制剂NS-398在体外可通过COX-2依赖途径，诱导胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞增殖，这为COX-2抑制剂有可能用于胃癌的预防和治疗提供了一定的实验理论依据。

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