尾加压素及其受体在大鼠肺缺血-再灌注损伤中的表达

马立民 饶旭光 段明科 杨伟 黎佩剑

[摘要] 目的 研究尾加压素Ⅱ及其受体UT在大鼠肺缺血-再灌注损伤中的表达。 方法 采用免疫组织化学方法观察UⅡ及其受体UT在缺血及再灌注不同时段大鼠肺组织中的变化，同时应用酶联免疫吸附方法测定相应时段血浆中的UⅡ的浓度。 结果 UⅡ及UT在肺组织多种细胞中广泛分布，缺血及再灌注后，UⅡ及UT在肺组织各种细胞中表达增强，相应血浆UⅡ的浓度变化与之一致。 结论 缺血及再灌注损伤可以促使肺组织中多种细胞合成、分泌、释放UⅡ，同时上调UT的表达。

[关键词] 尾加压素；受体；缺血-再灌注损伤；肺

[中图分类号] R-332???[文献标识码] A???[文章编号] 2095-0616（2012）15-24-02

Expression of urotensinⅡand its receptors during ischemia-reperfusion injury in rats in vivo

MA?Limin1??RAO?Xuguang1??DUAN?Mingke2??YANG?Wei1??LI?Peijian3

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515040,China;2.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the Second Hospital of Xiamen, Xiamen 361000,China; 3.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,People's Central Hospital of Huizhou, Huizhou 516000,China

[Abstract] Objective To investigate the expression of urotensinⅡand its receptors during ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Using IHC to observe the levels of UII and UT of rat pulmonary tissues and Using ELISA to observe the levels of UⅡ and UT of rat pulmonary tissues in different groups. Results UⅡ and UT was widely distributed in a variety of pulmonary cells.Its expression was boosted in pulmonary tissues and plasma after appearance of ischemia and reperfusion,especially in reperfusion stage,ischemia,reperfusion and up-regulation the expression of UT. Conclusion Ischemia and reperfusion can promote lung tissue cells to synthesize and excrete release UⅡ.

[Key words] UrotensinⅡ;Receptors;Ischemia-reperfusion injury;Lung

随着细胞保护概念的提出，人们开始认识到，激发与扶植机体内源性的抗损伤能力是细胞保护的最有效的措施。尾加压素Ⅱ（UrotensinⅡ，UⅡ）作为一种人体新发现的神经肽，其病理生理意义尚不十分清楚。本研究采用动物实验建立鼠肺缺血-再灌注损伤模型，观察了内源性UⅡ及其受体UT在肺缺血-再灌注损伤中的表达的变化。

1?资料与方法

1.1?一般资料

成年健康雄性SD大鼠24只，体重280～320 ｇ，由汕头大学医学院实验动物中心提供（批号：S20091004）；主要试剂：UⅡ及UT多克隆抗体，生物素标记二抗，DAB显色试剂盒及 SABC试剂盒（武汉博士德生物有限公司）、UⅡ酶联免疫吸附试剂盒（美国 Phoenix Pharmaceutical INC）。

1.2?模型制备

3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔内注射麻醉，麻醉成功后每只大鼠肌肉注射阿托品0.4 mg（徐州莱恩药业有限公司，

H32021060），气管切开后气管内插管连接小动物呼吸机控制呼吸（TKR-200C型，江公司西特力麻醉呼吸机设备有限），呼吸频率60次/min，吸呼比1∶1.5，工作压力（即潮气量）0.02 MP，吸氧浓度（FiO2）1.0。经左胸第5肋间进入胸腔，游离左侧肺门，由肺门下方绕过阻断线，然后在线的末端套塑料胶管形成活结备阻断用，阻断前5 min每只大鼠由阴茎背静脉注射肝素100 U/kg。30只大鼠随机分为3组，每组10只：对照组（C组）：完成以上手术操作，但肺门不阻断；单纯缺血组（I组）：缺血1 h；缺血再灌注组（I/R组）：缺血1 h，再灌注2 h。试验结束后在各时点用放血法处死动物。切取新鲜左肺门组织块，用40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片。石蜡切片经常规脱蜡、水化，滴加一抗后，按试剂盒说明常规SP法对切片标本进行染色，DAB显色，蒸馏水洗、脱水、透明、封片。阳性染色为胞浆棕色颗粒。阴性对照以PBS代替一抗。

1.3?指标检测

肺动脉血4 mL放入含10%EDTA-Na2和抑肽酶的试管中混匀，3 000 r/min离心10 min（5804R高速低温离心机，德国eppendorf公司），分离血浆，注入EP管中，置-70℃冰箱保存待测。血浆UⅡ水平的测定均采用酶联免疫吸附试剂盒ELIS A法，按试剂盒说明书进行。切片观察及结果判定：UⅡ及受体UT的阳性细胞为胞浆内呈现棕黄色颗粒。采用计算机图像系统分析摄片，光镜下每张切片各取5个视野（目镜×40），分别计数各部位阳性细胞率（阳性细胞数/视野内细胞总数×100%）。

1.4?统计学处理

用SPSS11.0统计分析软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2?结果

2.1?大鼠肺组织中UⅡ及UT的变化

UⅡ及UT的变化主要表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞、血管内皮细胞、支气管上皮细胞、巨噬细胞和浸润的中性粒细胞。表达水平变化见表1。

2.2?大鼠血浆中UⅡ的变化

正常情况下血浆内有少量UⅡ存在，经缺血以及再灌注损伤后，UⅡ的含量明显升高，I组以及IR组与C组比较，UⅡ的含量差异有统计学意义（P＜0.05）。而再灌注损伤后其水平比单纯缺血组亦有明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。UⅡ的表达水平变化见表1。

3?讨论

目前肺移植已发展成为治疗终末期肺疾病的有效手段之一，但与心﹑肝﹑肾等实质器官比较，成功率较低。其中移植肺功能低下是影响肺移植疗效的一个重要问题，而移植过程中缺血-再灌注损伤对肺的损害是重要原因[1]。肺缺血-再灌注损伤的机制是多方面的，国内外学者研究发现，一氧化氮合成酶活性的变化、氧自由基的产生、内皮细胞激活、中性粒细胞浸润、脂质过氧化与炎性介质的释放是介导肺缺血-再灌注损伤的重要因素[2]。随着细胞保护概念的提出，人们开始认识到，激发与扶植机体内源性的抗损伤能力是细胞保护的最有效的措施。

UT是一种孤立的G蛋白藕联受体即GPR14，原位杂交显示GPR14在人类整个神经系统都有表达，在外周主要表达于血管平滑肌、气道平滑肌、血管内皮、心肌等[3]。在慢性缺血、缺氧过程中和PTCD术后，血液中存在内源性UⅡ含量的增加，肺血管也存在受体UT表达的变化，提示UⅡ对肺脏的病理生理有影响[4]。Gibosin A等[5]报道UⅡ能以剂量依赖性方式直接刺激一氧化氮合成酶（NOS）激活，增加血管组织一氧化氮的生成和组织cGMP的含量，引起平滑肌松弛，血管扩张。同时有研究[6]证实，一氧化氮能扩张肺血管，升高细胞内cGMP，降低细胞内钙浓度，对肺缺血-再灌注损伤有保护作用。

本研究发现，与C组比较，I组及IR组肺组织经过缺血及再灌注后肺组织中UⅡ及UT的表达水平均明显升高（P＜0.05），且再灌注后肺组织中UⅡ及UT的表达水平较单纯缺血组亦明显升高（P＜0.05）。而血浆中UⅡ水平的变化与之一致。结合相关文献资料笔者推断：生理情况下血浆及组织中UⅡ含量低，不作为循环激素发挥主要作用，也不起主要的自分泌和旁分泌作用。在肺组织缺血以及再灌注损伤的刺激下UⅡ以自分泌和旁分泌方式分泌增多，在局部组织及循环中发挥作用，同时其靶器官受体UT的表达也发生变化。UⅡ作为机体内源性保护机制，激发抗损伤能力，减轻肺缺血-再灌注所致的细胞损伤。但需进一步实验阐明UⅡ在肺缺血-再灌注损伤中的机制。

[参考文献]

[1] Bittner HB，Binner C，Dahlberg P，et al.Reducing ischemia-reperfusion injury in clinical lung transplantation[J].Transplant Proc，2007，39（2）：489-492.

[2] Ovechkin AV，Lominadze D，Sedoris KC，et al.Lung ischemia-reperfusion injury:implications of oxidative stress and platelet-arteriolar wall interactions[J].Arch Physiol Biochem，2007，113（1）：1-12.

[3] Douglas SA，Ohlstein EH.Human urotensinⅡ，the most potentmammalian vasoconstrictor identified to date， as a therapeutic target for the management of cardiovascular disease[J].Trends Cardiovasc Med，2000，10：229-237.

[4] 赖荣德，梁子敬.尾加压素Ⅱ受体拮抗剂对急性肺损伤大鼠血浆及肺泡灌洗液中尾加压素Ⅱ的影响[J].中华急诊医学杂志，2006，15（11）：975-977.

[5] Gibosin A，Conyers S，Bern HA，et al.The influence ofurotensin Ⅱ on calcium flux in rat aorta[J]. J Pharmacol，1988，40：893-895.

[6] Esme H，Fidan H，Solak O，et al.Beneficial effects of supplemental nitric oxide donor given during reperfusion period in reperfusion-induced lung injury[J].Thorac Cardiovasc Surg，2006，54（7）：477-483.

（收稿日期：2012-05-09）