Bcl2-siRNA提高人肺腺癌细胞A549/DDP对顺铂敏感性的研究

张学林，余秉翔

解放军总医院 呼吸科，北京 100853

siRNA(small interfering RNA)是一种长约21-25bp的小RNA分子，由Dicer(RNAse Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成，是RNA干扰(RNA interference，RNAi)途径中的中间产物，siRNA通过与一系列特异性蛋白质结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，再由RISC切割靶mRNA最终导致翻译受阻，产生转录后基因沉默效应(PTGS)。在细胞内，siRNA能在低于反义核苷酸几个数量级的浓度下，使靶基因表达水平降低，甚至可达完全“敲除”的效果[1]。肺癌在我国的发病率与死亡率已居恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占80%以上，其五年生存率仅8%-10%，65%患者诊断时已为晚期[2]。铂类药物联合其他化疗药物是治疗NSCLC的主要方案，但是多药耐药现象影响化疗疗效[3-4]。越来越多研究表明Bcl-2基因与肿瘤耐药关系密切。本研究以人肺腺癌顺铂耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞A549为模型，通过siRNA降低肿瘤细胞中Bcl2 mRNA及蛋白的表达，进而增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性，为研究肺癌顺铂耐药提供依据。

材料和方法

1 试剂与仪器 注射用顺铂(冻干型)为齐鲁制药产品；jetPRIME转染试剂购于PolyPlus-transfection公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自DOJINDO公司；TRI Reagent购自Sigma公司；反转录试剂盒购于Promega 公司；荧光PCR试剂购于TaKaRa公司；Bcl-2、GAPDH抗体购于Santa Cruz公司。siRNA由上海吉玛公司合成(Negative Control RNA序 列 为 ：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siBcl-2序 列[5]为 ：5'-UGUGGAUGACUGAGUACCUGAdTdT-3'，5'-UCAGGUACUCAGUCAUCCACAdTdT-3')； 其 余试剂均为进口分装或国产分析纯。Mx3000p荧光实时定量PCR仪由Stratagene生产；MS酶标仪由芬兰Labsystems生产。

2 细胞株培养 人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549(ATCC)购于中国医学科学院肿瘤研究所。细胞用RPMI-1640培养液加含10%胎牛血清(Hyclone)和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，于37℃、5% CO2孵箱中孵育。为保持A549/DDP细胞耐药性，在新鲜配置的含1μg/ml顺铂培养液中培养，常规消化、传代。实验前2d，A549/DDP细胞培养液换为不含顺铂培养液。

3 测定A549/DDP耐药系数 取对数生长期的A549/DDP细胞和A549细胞铺于96孔板，每孔3.0×103个细胞，16h后换为含不同浓度顺铂的培养液，A549培养液顺铂浓度为(0、0.5、1、1.5、2、3μg/ml)，A549/DDP培养液顺铂浓度为(0、3、6、9、12、15μg/ml)，每个浓度5个复孔。药物作用48h后，换为新鲜配置的含10% CCK-8液的培养液100μl，置孵箱继续培养，1h后用多功能酶标仪于450nm波长下检测每孔吸光度值(A)。按公式计算每个浓度的顺铂对细胞生长的抑制率(IR)：IR(%)＝(1-Ai/A0)×100%(Ai为各浓度顺铂组的平均吸光值，A0为不加顺铂组的平均吸光值)。并计算顺铂对细胞的半数抑制浓度(IC50)。耐药系数RI=IC50A549/DDP/IC50A549。实验重复3次，取平均值。

4 转染 取对数生长期A549/DDP细胞接种于6孔板，每孔1.0×105个细胞，接种16h后采用jetPRIME转染试剂，按说明书进行转染。每孔转染双链RNA终浓度为20nmol/L。转染24h后换为不含顺铂的正常培养液。实验分阴性对照组(NC组)和转染siBcl-2组。

5 Real time RT-PCR检测Bcl-2 mRNA的表达水平总RNA的提取采用TRI Reagent法，按照说明书进行。总RNA提取后逆转录为cDNA，按照说明书操作。以GAPDH为内参照扩增Bcl-2基因。GAPDH上 游 引 物：5'-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3'， 下 游 引 物：5'-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。Bcl-2上 游 引 物：5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3'， 下 游 引 物：5'-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3'。用2-ΔΔCt方法处理实时定量数据，计算Bcl-2 mRNA的表达差异。实验重复3次，取平均值。

6 细胞凋亡检测 细胞转染32h后，接种于96孔板，每孔3.0×103个细胞，接种16h后换为新鲜配置的含不同浓度顺铂的培养液(0、3、6、9、12、15μg/ml)，药物作用48h后，按方法3测吸光度A值，并计算两组的IC50值，比较转染siBcl-2后A549/DDP对顺铂敏感性的变化。实验重复3次，取平均值。

7 Western Blot检测Bcl-2蛋白的表达 用RIPA裂解液收集转染后细胞，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后，利用10%的SDS-PAGE胶进行分离等量蛋白，然后转膜、封闭，加入1∶1 000稀释的兔抗人Bcl-2单克隆抗体，以及1∶5 000稀释的二抗。最后加入发光试剂，曝光、显影。以GAPDH为内参照。

8 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量数据以-x±s表示，两组独立样本采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 A549/DDP细胞耐药系数测定 加药48h后，顺铂(DDP)对A549及A549/DDP细胞的增殖均有抑制作用(图1、2)。顺铂对A549细胞的IC50值为(1.68±0.26)μg/ml，对A549/DDP细胞的IC50值为(10.92±1.15)μg/ml，A549/DDP细胞的耐药系数为6.49(P<0.05)(图3)。

2 Bcl-2 mRNA及蛋白在A549及A549/DDP细胞中的差异表达 提取细胞中RNA后，通过逆转录及Real time RT-PCR检测Bcl-2 mRNA的表达。Bcl-2 mRNA在A549/DDP细胞中的表达水平是A549细胞的3.77±0.56倍(P<0.05)(图4)。收集6孔板中A549及A549/DDP细胞，以GAPDH为内参照，检测两者之间Bcl-2蛋白的差异，由图5示，A549/DDP细胞中Bcl-2蛋白表达明显高于A549细胞。

3 siBcl-2的干涉效果 在A549/DDP细胞中转染双链RNA 48h后，siBcl-2组同NC组相比，Bcl-2 mRNA表达水平降低了92.6%(P<0.05)(图6)，其蛋白表达也明显降低(图7)，几乎达到“敲出”该基因的效果，说明其干涉效果良好。

4 转染siBcl-2后A549/DDP对顺铂的敏感性 在A549/DDP细胞中转染RNA后，siBcl-2组顺铂的IC50值为(4.83±0.76)μg/ml；NC组顺铂的IC50值为(11.47±1.02)μg/ml；敏感性提高了57.8%(P<0.05)(图 8、9)。

图 1 顺铂对A549细胞的抑制率 图 2 顺铂对A549/DDP细胞的抑制率 图 3 顺铂对A549及A549/DDP细胞的IC50值Fig 1 Cisplatin-inhibiting rate for A549 cells Fig 2 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cell Fig 3 IC50 value of cisplatin for A549 and A549/DDP cells

图 4 Bcl-2 mRNA在A549及A549/ 图 5 Bcl-2 蛋白在A549及A549/DDP 图 6 转染后A549/DDP细胞中Bcl-2 mRNA DDP细胞中的表达 细胞中的表达 的表达Fig 4 Expression of Bcl-2 mRNA in A549 and A549/DDP cells Fig 5 Expression of Bcl-2 protein in A549(1) and A549/DDP(2)cells 1: The protein level in A549 cells; 2: The protein level in A549/DDP cells Fig 6 Expression of Bcl-2 mRNA in A549/DDP cells after transfection NC: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The Bcl-2 mRNA level in A549/DDP cells after transfection of siBcl-2 RNA

图 7 转染后Bcl-2 蛋白在A549/DDP 图 8 转染后顺铂对A549/DDP细胞 图 9 转染后顺铂对A549/DDP细胞的IC50值细胞中的表达 的抑制率Fig 7 Expression of Bcl-2 protein in A549/DDP cells after transfection 1: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of negative control RNA; 2: The protein level in A549/DDP cells after transfetion of siBcl-2 RNA Fig 8 Cisplatin-inhibiting rate for A549/DDP cells after transfection NC: The inhibition rate after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The inhibition rate after transfection of siBcl-2 RNA Fig 9 IC50 value of cisplatin for A549/DDP cells after transfection NC: The IC50 value after transfection of negative control RNA; siBcl-2: The IC50 value after transfection of siBcl-2 RNA

讨 论

肺癌耐药的机制十分复杂，至今仍未完全阐明，有多种基因参与此过程，其中Bcl-2基因在肿瘤的发生发展中起重要作用[6]。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，B细胞淋巴瘤/白血病)基因，是1984年Jsujimoto等在研究B细胞滤泡性淋巴瘤中分离出来的一种原癌基因。正常的Bcl-2基因定位于染色体18q1.3上，大小约230kb。该基因编码26×103kDa大小的蛋白，位于线粒体膜、滑面内质网和核膜上。该基因能抑制诸如抗肿瘤药等凋亡信号引起的细胞凋亡[7]。有数据显示，Bcl-2基因的高表达导致多种肿瘤对化疗药物耐药[8]。Bcl-2不阻止药物进入细胞，不抑制药物引起的DNA损伤，也不改变细胞对DNA的修复速率和细胞周期动力学，该基因导致耐药的机制主要是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径实现的[9]。

有报道，Bcl-2基因的高表达与子宫内膜癌等多种肿瘤对化疗药物的耐药有关[10]。Bcl-2低表达的卵巢癌对化疗反应良好[11]。戴明等[12]发现人肺腺癌细胞紫杉醇耐药与Bcl-2高表达有关。但是也有报道称Bcl-2的低表达与乳腺癌细胞MCF-7多西他赛耐药有关[13]。

本研究中我们以人肺腺癌顺铂耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞A549为模型，发现A549/DDP中Bcl-2 mRNA表达的表达量为A549的3.77±0.56倍，其蛋白表达量也明显升高。通过在A549/DDP细胞转染Bcl2-siRNA，使Bcl-2 mRNA及蛋白在细胞中的表达明显降低，从而使顺铂对A549/DDP细胞的半数抑制浓度IC50由(11.47±1.02)μg/ml下降到(4.83±0.76)μg/ml，大大提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。说明Bcl-2基因的表达与肺癌耐药关系密切，同时，本研究也证实了Bcl2-siRNA对于逆转肺腺癌顺铂耐药具有确切的作用，为肺癌耐药这一难题的攻克提供理论依据。

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