间充质干细胞和内皮祖细胞对脐血造血干／祖细胞体外扩增效力的影响

迟 玥，段海峰，于 庭＊

（1．吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2．军事医学科学院 放射与辐射研究所，北京100850）

近年来，脐血造血干细胞（HSCs）移植倍受关注，但由于脐血中HSCs数量不足以及输注后产生的成熟细胞生物动力欠佳等因素，使脐血HSCs移植的应用受到了限制。因此，许多学者致力于HSCs体外扩增的研究，寻求适宜的HSCs体外扩增环境，提高脐血HSCs质量成为亟待解决的问题。

间充质干细胞（MSCs）是最早发现于骨髓基质中的一种多能干细胞，它具有多向分化潜能、能形成有利于HSCs生长的微环境［1］，可以分泌与 HSCs生长相关的黏附分子、细胞外基质和多种细胞因子［2］，支持造血并促进HSCs体内植入。内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，近期发现该细胞也是构成HSCs微环境的成员之一，并通过分泌干细胞因子（SCF）等多种因子影响HSCs的增殖和自我更新［3］。此外已有研究表明，人脐带沃顿胶中分离出的MSCs可衍生为EPCs［4］，EPCs可分泌细胞因子调节MSCs的活性［5］，并且MSCs与EPCs可互为对方的生长微环境，影响对方细胞的增殖和分化［6］。故MSCs、EPCs以及HSCs三者的关系是近年研究的热点和趋势。

虽然目前国内外已分别研究了MSCs及EPCs对HSCs体外扩增的影响，但尚未阐明两者对HSCs作用的差异性。因此，本研究通过将MSCs、EPCs作为滋养层细胞，与HSCs／HPCs接触共培养，比较两者对HSCs／HPCs扩增能力、表面抗原CD34的表达以及集落形成能力的作用差异性，为寻求一个更适合HSCs体外大量扩增的微环境奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞和脐带血 脐带间充质干细胞由军事医学科学院放射与辐射研究所分离及鉴定；内皮祖细胞由解放军307医院CTC中心实验室惠赠；脐血由北京中西医结合医院产科提供。

1．1．2 试剂 甲基纤维素、胰蛋白酶为Sigma公司产品；人淋巴细胞分离液为天津TBD公司产品；胎牛血清、台盼蓝染液为Gibco公司产品；Iscovo’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、Minimum Essential Medium Alpha Medium（α－MEM）为Invitrogen 公 司 产 品；Endothelial Cell Medium（ECM）为Sciencell公司产品；丝裂霉素C（mitomycin C）为INALCO公司产品；甲基纤维素半固体培养基（MethoCultTMH4434）为 StemCell Technologies公司产品；抗人CD34－PE、抗人CD45－FITC为BD pharmingen公司产品；EDTA为国药集团化学试剂有限责任公司产品；HEPES为Ameresco公司产品。

1．2 方法

1．2．1 脐带血MNCs的分离和鉴定 无菌采集健康产妇足月妊娠的脐血标本，当日分离。以脐血：PBS：0．5%甲基纤维素＝1∶3∶1的比例混合。室温静置30min。小心吸取上清离心，1 600rpm，10 min，22℃，得有核细胞。所得有核细胞用10倍以上体积 PBS洗涤一次，离心，1 500rpm，6min，22℃。重悬于5ml PBS，混匀。在15ml离心管底部加入5－10ml人淋巴细胞分离液，将细胞悬液小心加入其上。离心1 500rpm，30min，22℃。小心取出离心管，溶液分为3层：从上至下依次是透明的PBS层，单个核细胞层，红细胞层。吸出单个核细胞层，加入30ml PBS混匀，1 500rpm，5min离心洗涤；再用10ml PBS同条件离心再洗涤一次。弃上清后沉淀为所需MNCs，为共培养和鉴定备用。

计数后，用抗人CD34－PE和抗人 CD45－FITC双色标记106个细胞，FACS Calibur流式细胞仪检测其中CD34＋CD45－的细胞所占比例。

1．2．2 滋养层细胞的制备 4－6代 MSCs接种在含α－MEM（含人血小板裂解物［7］）培养液的培养皿中，于温度为37℃，CO2浓度为5%的饱和湿度培养箱中培养，每2天换液一次，至80%－90%融合时，0．05%胰蛋白酶消化传代，细胞铺于6孔板（Corning公司）中的两个孔，每孔2×105个细胞。加入2mlα－MEM培养液按上述条件培养至80%－90%融合。吸出培养基后，每孔用无血清IMDM洗两次，加入终浓度为10μg／ml的丝裂霉素C，于温度为37℃，CO2浓度为5%的饱和湿度培养箱中培养2．5h，无血清IMDM洗3次，作为MSCs滋养层备用［8］。

4－6代EPCs接种在含ECM完全培养液的培养皿中，于温度为37℃，CO2浓度为5%的饱和湿度培养箱中培养，每2天换液一次，至80%－90%融合时，0．05%胰蛋白酶消化传代，细胞铺于6孔板中的两个孔，每孔2×105个细胞。加入2ml ECM培养液按上述条件培养至80%－90%融合。吸出培养基后，每孔用无血清IMDM洗两次，加入终浓度为2．5μg／ml的丝裂霉素C，于温度为37℃，CO2浓度为5%的饱和湿度培养箱中培养2．5h，无血清IMDM洗3次，作为EPCs滋养层备用。

1．2．3 MSCs和EPCs分别与 MNCs共培养 共培养分为3组：对照组（无滋养层），MSC组（MSC细胞滋养层），EPC组（EPC细胞滋养层），每组2个复孔。加入新分离的 MNC105个细胞／孔，每孔加入2ml含10%胎牛血清的IMDM培养基。共培养2－3d半换液一次，并将所有 MNCs转移至相应的丝裂霉素C处理后的滋养层继续培养。分别在共培养第0d、4d、7d观察显微镜下每孔细胞增殖情况并拍照，并用4%台盼蓝染液以1∶1比例染色后计数每孔活细胞数。

1．2．4 流式细胞术分析 吸出共培养7d后的各孔细胞，用抗人CD34－PE和抗人CD45－FITC抗体双色标记细胞，FACS Calibur流式细胞仪检测3组MNCs的CD34＋CD45－细胞所占比例。每组各设一个对照管和一个样本管。

1．2．5 造血祖细胞集落分析 实验共设3组：第一组为脐血中新分出的MNCs；第二组为共培养4d后，对照组（无滋养层），MSC组（MSC细胞滋养层），EPC组（EPC细胞滋养层）中的MNCs，第3组为共培养7d后，对照组（无滋养层），MSC组（MSC细胞滋养层），EPC组（EPC细胞滋养层）中的MNCs。共培养后的7组MNCs均以2×105／ml的密度接种于甲基纤维素半固体培养基中，每组3个复孔，于温度为37℃，CO2浓度为5%的饱和湿度培养箱中培养，7－10d后观察集落生长情况，计数3组每个孔 CFU－E，BFU－E，CFU－GEMM，CFU－GM，CFU－G和CFU－M的总集落数，并进行比较。

1．2．6 统计学分析 多组计量资料的比较，采用方差分析的两两比较。

2 结果

2．1 共培养过程中，3组MNCs的扩增情况和扩增倍数的比较

图1－1 共培养过程中3组MNCs的扩增情况

图1－1结果所示，本组内部比较，对照组、MSC组、EPC组的扩增细胞数在第4天、第7天均较第0天呈增加趋势。同时，第4天和第7天MSC组、EPC组的扩增细胞数均较对照组为多，且EPC组的细胞数增加更明显。

图1－2 共培养过程中三组MNCs扩增倍数的比较

图1－2结果所示，共培养第4天，MSC组扩增细胞数约为对照组的1．71倍（＊＊，P＜0．01），EPC组扩增细胞数约为对照组的2．93倍（＊，P＜0．05），EPC组扩增细胞数约为 MSC组的1．57倍但差异无统计学意义。共培养第7天，MSC组扩增细胞数约为对照组的1．38倍（＊，P＜0．05），EPC组扩增细胞数约为对照组的2．10倍（＊＊，P＜0．01），EPC组扩增细胞数约为 MSC组的1．53倍（＊＊，P＜0．01）。共培养第4天与第0天比较，对照组扩增倍数约为2．025（＊＊，P＜0．01），MSC组扩增倍数约为3．775（＊＊，P＜0．01），EPC组扩增倍数约为5．925（＊，P＜0．05）；共培养第7天与第0天比较，对照组扩增倍数约为3．975（＊＊，P＜0．01），MSC 组扩增倍数约为 5．475（＊＊，P＜0．01），EPC 组扩增倍数约为 8．350（＊＊，P＜0．01）；共培养第7天与第4天比较，对照组扩增倍数约为1．96（＊＊，P＜0．01），MSC组扩增倍数约为1．45（＊，P＜0．05），EPC 组扩增倍数约为1．41（＊，P＜0．05）。

2．2 流式细胞术分析扩增前后CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例的变化

图2－1结果所示，扩增前CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占MNCs的2．20%。

图2－2结果所示，共培养7天后，对照组CD34＋CD45－的HSCs／HPCs占 MNCs的1．40%；MSC组CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的1．85%；EPC组CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs占 MNCs的0．41%。

图2－3结果所示，共培养7天后，3组MNCs中CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例均较扩增前明显下降。其中，MSC组CD34＋CD45－的 HSCs／HPCs所占比例下降幅度没有对照组显著，而EPC组CD34＋CD45－的HSCs／HPCs所占比例较对照组下降更显著。

2．3 共培养过程中，3组HSCs／HPCs集落形成能力的分析

图2－1 扩增前HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

图2－2 共培养7d后3组HSCs／HPCs表面抗原CD34／CD45

图2－3 共培养过程中HSCs／HPCs CD34表达的变化情况

图3 共培养过程中3组HSCs／HPCs集落形成能力的分析

如图3所示，共培养第4天和第7天，对照组和EPC组的HSCs／HPCs集落形成总数均较扩增前明显下降，MSC组的HSCs／HPCs集落形成总数则呈增加趋势。

共培养第4天的HSCs／HPCs，MSC组的集落形成总数为对照组的2．55倍（＊＊，P＜0．01），为EPC组的2．47倍（＊＊，P＜0．01）；共培养第7天的HSCs／HPCs，MSC组的集落形成总数为对照组的3．73倍（＊＊，P＜0．01），为EPC组的3．45倍（＊＊，P＜0．01）；共培养第4天与第7天的HSCs／HPCs，EPC组与对照组的集落形成总数均无显著差异。

3 讨论

本研究中，为形成与HSCs／HPCs体内生长相似的细胞微环境，我们并未将分离出的MNCs再次筛选获得纯度较高的CD34＋细胞进行实验，而采用丝裂霉素C分别处理MSCs和EPCs以抑制其分裂增殖，制备滋养层细胞后，将新鲜脐血中分离的MNCs分别接种于2种滋养层细胞和仅有培养基的3种环境中进行接触共培养，以7天为一个周期。通过对共培养体系的镜下观察和台盼蓝染色计数发现，3组MNCs数均随时间变化而增加，以EPC组MNCs增加最显著，MSC组次之。

为确定增加的MNCs中HSCs／HPCs的数量，我们从HSCs特征性表面抗原CD34的检测和HSCs／HPCs特有的集落形成能力这两个方面进行了探讨。研究发现，MSCs可维持HSCs／HPCs表面抗原CD34的存在，且可从数量和集落大小两个方面增强HSCs／HPCs的集落形成能力；而EPCs虽然使 MNCs总数显著增加，但其中的CD34＋CD45－的HSCs／HPCs比例明显下降，且在改变HSCs／HPCs的集落形成能力上无显著作用。其中，MSCs对HSCs／HPCs的扩增作用可能与其分泌的多种细胞因子，以及多因子参与的信号通路有关［9］，如 Wnt［10］、Notch［6］；而 EPCs分泌的细胞因子及蛋白虽可增加细胞数量，但可能导致多潜能HSCs／HPCs选择性扩增和终末分化，从而促进CD34＋细胞系特异性分化，并可能降低 HSCs／HPCs在骨髓内归巢的能力［11］。因此，后续研究可分析MSCs与EPCs分泌的因子差异，从机制上探讨影响HSCs／HPCs体外扩增的可能关键因素。同时由于MSCs一定条件下可衍生为EPCs，且EPCs可分泌细胞因子调节MSCs的活性，故后续研究也可尝试将两种细胞同时置于HSCs／HPCs体外扩增的微环境中，探讨其共同作用及机制。

总之，本研究结果显示，MSCs和EPCs均可促进 HSCs／HPCs的体外扩增，提供适合 HSCs／HPCs生长的微环境。MSCs可有效促进HSCs／HPCs的体外扩增，并保持其造血重建潜能和归巢能力；而EPCs仅可增加扩增体系中的细胞总数，却不能维持 HSCs／HPCs的造血潜能，可能与促进HSCs／HPCs向成熟造血细胞分化有关。

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