人脐带血内皮祖细胞体外培养、增殖和迁移

王田蔚，方 乐，马晶波

（1．吉林大学中日联谊医院1．放射线科；2．神经内科，吉林 长春130033）

对血管内支架进行内皮化，有可能防止支架内再狭窄的发生，具有广阔的临床应用前景。文章采用新鲜脐血中分离的单个核细胞，在包含碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子的环境中培养及扩增，经过形态学对比，结合免疫荧光法和流式细胞仪鉴定贴壁细胞；并与同期采集的脐静脉内皮细胞在增殖和迁移能力两方面进行对比。

1 材料和方法

1．1 材料

研究方案由院属医学伦理委员会审核并批准，新鲜脐血标本来自我医院妇产科提供的足月妊娠健康产妇，事前均由产妇及家属授权。

1．2 试剂与检测仪器

人淋巴细胞分离液（LSM，美国 Mp bio公司）；M199培养液（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，美国Pepro Tech公司）；Dil标记乙酰化低密度脂蛋白（Dil－acLDL，Molecular probes公司）；人纤维连接蛋白、FITC 标记荆豆凝集素I（FITC－UEA－I，Sigma－aldrich 公 司 ）；FITC－CD34、PE－CD133（美 国eBioscience公司）；PerCP／Cy5．5－VEGFR－2（美国BioLegend公司）；CCK－8（日本同仁化学研究所）；Transwell小室（美国Costar公司）；倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；流式细胞分析仪（美国BD公司）；酶标仪（美国THERMO公司）。

1．3 实验方法

单个核细胞的分离：无菌离心管（预抗凝）采集脐血50ml；按1∶2的比例将PBS等倍稀释后的脐血沿离心管壁缓慢置于淋巴细胞分离液上，离心25 min（500g／min），离心后将交界处混浊灰白色的单个核细胞层小心吸出，在以M199培养液离心洗涤2次（300g／min）。

向EPCs的诱导分化：首先用诱导分化培养液重悬的单个核细胞（培养液包括含20%胎牛血清的M199培养液，VEGF10μg／L，bFGF10μg／L，青霉素100U／ml，链霉素100U／ml），再将其接种到24孔培养板（5mg／L人纤维连接蛋白包被），置孵育箱培养（37℃、5%CO2），3天后首次换液，每3天更换1次，当细胞融合达到80%后胰酶消化细胞进行传代培养，最终对比观察细胞的形态学变化，同时进行生物学检测。

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离与培养：新生儿脐带，0．25%胰蛋白酶（37℃预热）灌注脐静脉腔，37℃孵箱消化20min，终止消化，重悬细胞，并接种以及传代（条件同向EPCs的诱导分化）。

EPCs吞噬DiI－ac－LDL以及结合FITC－UEA－I的功能鉴定：培养至第7天时取爬片的贴壁细胞，按比例（3mg／L）加入 Dil－ac－LDL，孵育箱孵育4h（5%CO2、37℃），20g／L多聚甲醛固定，再次洗涤后加入FITC－UEA－I（10mg／L），37℃孵育1h，最终经DAPI对比染色后激光共聚焦显微镜进行鉴定。

EPCs表型鉴定：分别于培养至第7和28天时用流式细胞仪检测贴壁细胞，经胰酶消化后重悬细胞（细胞浓度为109L－1），加入 PE－CD133、FITCCD34和 PerCP／Cy5．5－VEGFR－2抗体，混匀后孵育30min（4℃并避光）。PBS洗去未结合的抗体，重悬后流式细胞仪检测（以未加抗体的细胞为阴性对照）。

增殖能力对比：分别接种EPCs和HUVECs于96孔板（两种细胞密度相同），每组均隔日取3孔利用CCK－8试剂盒检测细胞增殖数量，连续监测7个时间点（1－14天）并最终绘制细胞生长曲线。

细胞迁移能力对比：对比利用24孔transwell小室（8μm孔径）进行，上室加200μL的 M199培养液（含EPCs或HUVECs）；下室加诱导分化培养液孵育24h（37℃），擦去附着细胞，经染色后显微镜下计数，最终经醋酸脱色后将洗脱液用酶标仪测570nm吸光度值；本项实验重复3次。

本实验主要观察指标：①人脐血EPCs形态观察。②人脐血EPCs鉴定。③人脐血EPCs与HUVECs在体外增殖和迁移能力。

1．4 统计学分析 统计学分析采用SPSS17．0，数据以¯x±s表示，两组间比较应用t检验进行，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 单个核细胞细胞形态学变化

经分离洗涤后的单个核细胞呈悬浮的小圆形；至培养第3天时细胞明显贴壁并出现细胞集落；至第7天左右特征性克隆形成，细胞群的中央部分为圆形细胞，周围部分由梭形细胞放射状分布；至第14天左右，贴壁细胞多呈梭形，并出现线样排列，体积逐渐变大的同时边界逐渐清楚；至第28天，基本细胞长满底部，此时细胞呈“铺路石样”排列。

贴壁细胞荧光染色

摄取Dil－ac－LDL后细胞在激光共聚焦显微镜下表现为红色，经过FITC－UEA－I染色的细胞镜下表现为绿色，经DAPI复染后镜下细胞核为蓝色，上述三种染色均表现为阳性的正分化的EPCs，本实验阳性率大于90%。

流式细胞仪分析

经过7天培养后细胞的CD133、CD34和VEGFR－2表达分别占29．3±4．8%，51．7±7．5%和68．2±8．1%。培养28天的细胞CD34和VEGFR－2的表达分别占7．9±3．8%和78．2±6．5%，此时未见CD133表达。

2．2 细胞增殖对比

经过CCK－8试剂盒检测到的细胞增殖数量对比见增殖曲线（图1），其中EPCs从培养第7天开始增殖速度明显高于HUVECs，扩增后细胞数量可达109L－1。

图1 内皮祖细胞和人脐静脉内皮细胞的生长曲线

细胞迁移能力比较

EPCs迁移的细胞数明显多于HUVECs，表明EPCs迁移能力占优（P＜0．05）。两者吸光度值分别为0．283±0．03和0．269±0．02。

3 讨论

Asahara等［1］1997年首次从人类外周血中分离出EPCs，后续研究发现EPCs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞，有可能预防血管支架内再狭窄，因此具有非常重要的临床意义。EPCs的常见来源为骨髓、脐血和外周血。其中骨髓来源创伤和风险较大；外周血来源的含量极低，仅占单个核细胞总数的0．002%；脐血来源中的EPCs含量约为外周血的10倍［2］，且来源广泛，采集简便，对供者无不良影响，不涉及伦理学问题，较为理想。

复习以往文献，常用的EPCs分离方法是免疫磁珠分选法和密度梯度离心法。免疫磁珠分选法获得的EPCs纯度较高，但数量非常少，单独培养难以大量增殖，且操作较复杂，价格昂贵，其实验环境容易被污染，对培养中细胞的活性影响较大。相反，虽然密度梯度离心法获得的细胞纯度不高，但通过培养中贴壁筛选法仍可获得较高的纯度的EPCs，且经济性好，可重复性较强。本实验采用密度梯度离心法为基础，获得的实验结果令人满意。

EPCs的鉴定方法差异很大，根本原因在于EPCs缺乏特异性的表面标记。复习以往文献，多数研究中的鉴定是通过细胞摄取Dil－ac－LDL，经过FITC－UEA－I染色包括DAPI复染和（或）应用流式细胞仪分析CD34＋、CD133＋、VEGFR－2＋表达两种手段进行。一部分学者［3］认为正分化的EPCs能够同时吸收 Dil－ac－LDL和结合 FITC－UEA－I；另一部分注重细胞功能的学者［2］认为能表达CD34、VEGFR－2和CD133的细胞是功能性内皮细胞的前体细胞，并通过对心脏医用植入假体上被覆的新生内膜进行研究加以证实。本实验结合两种方案设计，综合不同分离、培养和鉴定方法的优缺点，既观察吸收 Dil－ac－LDL和结合 FITC－UEA－I的能力来判断细胞类型及细胞功能，又应用流式细胞仪进行表型鉴定时结果显示：经诱导分化后，细胞表面的CD133表达迅速下降最终于培养28天时消失；与之对应CD34和VEGFR－2等成熟内皮细胞的表面标志始终有表达，形态学观察显示最终分化为成熟内皮细胞应有的“鹅卵石样”典型形态。本实验结果表明EPCs经诱导可定向分化为成熟的内皮细胞，这与已有文献报道相一致［4－7］，表明前述方法可以获取较高纯度和同源性的EPCs。

EPCs具有迟发高增殖潜能，这是功能上区别于成熟内皮细胞的主要特性。在体外环境下成熟内皮细胞4－6周后增殖能力明显下降；而EPCs在培养15－20天后形成的内皮细胞，形态学呈迅速生长的典型“鹅卵石”样排列，此形态学特征能稳定传30代以上。既往研究表明EPCs在适宜的条件下可以快速增殖、分化，增殖的能力可以达到内皮细胞的10倍以上［8］，短时间培养即可达到覆盖血管支架表面所需的数量。通过对EPCs和HUVECs的增殖和迁移能力进行对比分析，本实验结果也提示EPCs可以快速增殖、分化，增殖能力明显优于HUVECs，且迁移能力也明显优于后者，这为EPCs应用于血管支架材料提供了理论依据。

综上所述，结合密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、纯化脐血来源EPCs，经适当环境诱导分化，可向成熟内皮细胞转化，形成的内皮细胞具有迅速生长的形态学特征且能稳定传代，在体外环境中可大量扩增。EPCs可能成为预防血管支架内再狭窄的理想被捕获细胞来源。

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