尿膀胱癌抗原、透明质酸和存活素联合检测对膀胱癌的诊断运用探讨

周 毅，王 伟，姚 远，杨剑文，卢启海

（广西医科大学第五附属医院·柳州市人民医院 泌尿外科，广西 柳州545006）

世界范围内，膀胱癌位列男性最常见实体瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新诊断的膀胱癌患者超过350000名。近几年，我国部分城市膀胱癌的发病率呈现稳中有升的趋势。国内大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的发病率已位列男性常见恶性肿瘤的第六位，而死亡率位列第七位。大部分患者都是因为肉眼或镜下血尿怀疑膀胱癌而做检查的；其他一些可能有排尿刺激症状，如尿频、尿急、尿痛；还有一些是由于尿脱落细胞学阳性，或者因为腰背疼痛做CT检查时发现膀胱里面有肿块。本研究通过探讨在对膀胱癌的诊断过程中，尿膀胱癌抗原、透明质酸和存活素的应用价值。

1 对象与方法

1．1 研究对象

本研究共104例患者，其中男79例，女15例，年龄34－79岁，平均66岁。共分两组，第1组为膀胱癌组：膀胱癌患者74例，男61例，女13例，年龄42－79岁，平均63岁；74例膀胱癌患者均经术后病理检查证实为膀胱移行细胞癌，其中G1 12例、G2 43例、G3 19例，pTa 40例、pT1 21例、pT2及以上13例。行膀胱全切6例，膀胱部分切除12例，经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBt）56例。第2组为对照组：泌尿系统良性疾病患者20例，男16例，女4例；年龄32－70岁，平均51岁，包括尿道感染、尿石症、良性前列腺增生、肾小球肾炎、神经原性膀胱、尿道狭窄等。第3组为健康志愿者标本10例，行膀胱镜检查前留取清洁中段单次晨尿50－100ml，分组编号，每例尿样分为4份。膀胱镜检查肿瘤部位、大小、数目，并作肿瘤活检和随机活检。根据病理进行肿瘤分级和分期。1．2 实验方法

试验方法：膀胱镜检查或术前常规留取晨尿，每例尿样分4份，分别行膀胱癌抗原（UBC）、透明质酸（HA）、存活素（Survivin）和尿脱落细胞学检查。UBC、HA和Survivin检测具体实验步骤参照产品说明书。

1．2．1 UBC：ELISA法检测 UBC，试剂盒购自瑞典IDLBiotech公司。按照试剂说明书以12μg／L为尿UBC诊断膀胱癌的阳性临界值。

1．2．2 HA：放射免疫法测定HA，HA放射免疫分析测定盒购自上海海研医学生物技术中心。以大于正常对照组HA上限144．7μg／L为临界值。

1．2．3 存活素（Survivin）：采用 RT－PCR（TaKaRa公司）方法检测尿脱落细胞中存活素特异性DNA条带。RNA提取采用TRIZOL试剂（美国Invitrogen公司）。

存活素 （279bp）外引物：F1：5′－CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA－3′，R1：5′－AATAAACCCTGGAAGTGGTGGCA－3′；内 引 物：F2：5′－CCGCATCTCTACAT－CAAGAAC－3′，

R2：5′－CTTGGCTCTTTCTCTGTCC－3′，

β－actin （309bp） 引 物：F：5′－AGCGGGAAATCGTGCGTC－3′，

R：5′－CAGGGTACATGGTGGTGCC－3′。由大连宝生物工程有限公司合成。1．2．4 尿脱落细胞检查：采用吖啶橙染色及HE染色，吖啶橙染色分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级；HE染色分为阴性、轻度核异质、中度核异质、重度核异质、肿瘤细胞5级。吖啶橙染色Ⅲ－Ⅴ级定为阳性，HE染色中度核异质、重度核异质、肿瘤细胞定为阳性［1］。

1．3 统计学方法

采用SPSS11．5软件进行统计学分析，采用方差分析（ANOVA）、χ2检验、t检验，P＜0．05 表示有统计学意义。

2 结果

2．1 健康志愿者、泌尿系统良性疾病患者与膀胱癌患者UBC、HA和尿脱落细胞学检查的比较 按照试剂说明书以12μg／L为UBC诊断膀胱癌的临界值，以大于正常对照组尿液 HA水平上限144．7 μg／L为HA阳性界值。

三组患者比较，膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的阳性率分别为86．5%（64／74），89．2%（66／74），93．2%（69／74），40．5%（30／74）；良性泌尿系疾病患者UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的阳性率分别为 10．0%（2／20），20．0%（4／20），5．0%（1／20），10．0% （2／20）；健 康 志 愿 者UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的阳性率均为0．0%（0／10），UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的检测有利于膀胱癌的诊断，且UBC、HA、Survivin三者的有效性优于尿脱落细胞学的检测。见表1。

表1 三组患者UBC、HA和尿脱落细胞学检查结果的比较

2．2 UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值比较

UBC、HA、Survivin在检测膀胱癌的过程中，三者的敏感性高于尿脱落细胞学，有统计学意义（P＜0．05），但三者之间的比较无显著差异，无统计学意义。4种诊断方法在特异性上无显著差异，但在准确性上 UBC、HA、Survivin分别为62．9%、66．2%、65．2%明显高于尿脱落细胞学30．8%，有统计学意义（P＜0．05）。见表2。

表2 4种诊断方法的敏感性、特异性、准确性和阳／阴性预测值的比较

2．3 肿瘤分级、分期、形状、数目、是否复发与UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学检查敏感性的比较UBC、HA、Survivin在肿瘤的各分级（G1、G2、G3）和各分期（pTa、pT1、≥pT2）中的敏感性明显高于尿脱落细胞学，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有统计学意义（P＜0．05）。UBC、HA、Sur－vivin三者的敏感性在肿瘤的各分期中无显著性差异。UBC、HA、Survivin在肿瘤单发／多发和初发／复发中的敏感性明显高于尿脱落细胞学。三者在肿瘤多发的敏感性高于单发，在肿瘤的初发高于复发。见表3。

表3 4种诊断方法的敏感性（%）与肿瘤分级、分期、数目及初／复发的关系

3 讨论

膀胱癌是指膀胱内细胞的恶性过度生长。最常见的过度生长位于膀胱腔内，也就是膀胱的粘膜上皮。膀胱的粘膜上皮细胞称作尿路上皮细胞，由它生成的癌就称作尿路上皮癌，占到了所有膀胱癌的90%－95%，是最常见的一类膀胱癌。其他不太常见的膀胱癌有鳞状细胞癌和腺癌。细胞角蛋白（CKS）是分布于上皮细胞的中间纤维丝，属一类蛋白质的多基因家族，可在体内形成不溶于水的中间片段，具有上皮来源细胞的特异性［2］。UBC的实质即为膀胱肿瘤来源的CK8和CK18片段［3］，因检测技术简便且具较好的灵敏度和特异度，已成为目前诊断膀胱癌应用较多的CKS标志。透明质酸（Hyaluronic acid、HA）又名玻尿酸，透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。HA作为一种葡萄糖氨基酸，其广泛分部在结缔组织和体液中，调节内皮细胞功能是其主要的作用。HA与肿瘤的关系：癌细胞增殖致使HA合成增加；癌细胞浸润周围结缔组织导致HA释放增加；癌细胞作用与其它相关细胞间接产生HA；HA降解酶抑制物增加，降解受阻。近年来研究表明［4－7］，HA 对膀胱癌具有诊断价值，认为膀胱肿瘤细胞在浸润过程中释放的HAase分解组织内的HA，分解产物随尿排出导致尿中HA浓度变化，本研究结果与前面学者的研究相符［8］。

存活素（Survivin）是1997年发现的一种抗凋亡蛋白，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein）家族成员。存活素可通过抑制细胞凋亡、调控细胞周期和促血管形成作用促进肿瘤的发生发展。Survivin主要分布于胚胎组织及肿瘤，在成人（除胸腺、子宫内膜组织、睾丸）大多数肿瘤组织中Survivin表达水平异常升高［9］。已有研究发现，Survivin可以作为灵敏特异的膀胱癌早期诊断因子和指导预后的指标，且其与膀胱癌的分级、分期的相关性也已经得到证实。再对膀胱癌的研究过程，人们发现单一标志物的灵敏度和特异性有不同程度的差异，几种标志物的联合检测对提高膀胱癌诊断的灵敏度有较大的应用价值。因此，本研究联合检测尿膀胱癌抗原、透明质酸和存活素在膀胱癌诊断过程中的应用价值。

本实验显示膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脱落细胞学的阳性率均明显高于良性泌尿系疾病患者和健康志愿者，且UBC、HA、Survivin三者的有效性优于尿脱落细胞学的检测。UBC、HA、Survivin在检测膀胱癌的过程中，三者的敏感性和准确性上明显高于尿脱落细胞学，有统计学意义（P＜0．05），但在特异性上无显著差异，三者之间的比较无显著差异，无统计学意义。UBC、HA、Survivin在肿瘤的各分级和各分期、肿瘤单发／多发和初发／复发中的敏感性明显高于尿脱落细胞学，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有统计学意义（P＜0．05）。在肿瘤多发的敏感性高于单发，在肿瘤的初发高于复发。近年来研究膀胱癌肿瘤标志物的报道持续上升，发现众多膀胱肿瘤的分子标志，但大多数的作用机制尚不清楚，实验表明尿中UBC、HA、Survivin联合检测敏感性高和特异较好，且优于尿细胞学检查。提示UBC、HA、Survivin联合检测可作为膀胱肿瘤的一种新的瘤标。

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