人参皂甙Rb1对人视网膜色素上皮细胞DNA合成的抑制作用

王作书，李晓华，明 月＊

（1．吉林省消防总队医院，吉林 长春130061；2．吉林大学第二医院 眼科，吉林 长春130041）

人参皂甙Rb1（Ginsenoside Rb1）是由人参中提取三醇组皂甙，具有增强免疫功能、促进学习记忆、抗衰老、抗肿瘤、清除氧自由、改变碳水化合物和脂质代谢等多种生物学效应［1－3］；本室以往研究已证实 人 参 茎 叶 总 皂 甙 （Ginsenoside of Stems and Leaves，GSL）（含Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg2）和人参皂甙单体Rb2和Rg3有抑制RPE细胞增殖的作用，我们进一步观察了Rb1对培养的人RPE细胞增生的影响。

1 材料与方法

1．1 材料和试剂 培养的RPE细胞来源于孕26周流产胎儿人胚眼，主要试剂包括：改良的Eagle培养液（Delbecco，s modified Eagle，s medium DMEM培养液）（GIBCO），胎牛血清（FCS，GIBCO），溴化二甲噻唑二苯四氮唑蓝（MTT，北京华美生物工程公司），二甲基亚砜（DMSO，国产分析纯），3H－TDR购自北京原子能研究所，放射强度为lmCi。人参皂甙Rb1由吉林大学基础医学院药理研究室惠增，无色液体，实验前用DMEM溶解配成不同浓度。

1．2 方法

1．2．1 RPE细胞的培养 人胚眼球在无菌条件下，沿扁平部剪开，剔除前部组织、玻璃体及视网膜感觉部，后节眼杯用PBS液漂洗后在解剖显微镜下分成4块展平后，放入DMEM培养液中，显微镜下剥离RPE层，将得到的RPE置于0．25%胰蛋酶（trypsin）中消化30min，FCS终止消化，注吸法分离RPE，离心、清洗后接种于含20%FCS的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2的孵箱中培养。RPE细胞为贴附型细胞，取第5代用于实验。

1．2．2 药物浓度与效应关系实验 RPE细胞经酶消化后制成细胞密度2×104／ml细胞悬液，每孔2 ml接种于24孔塑料培养板，孵育24h后换为不含血清的DMEM培养液，加入人参皂甙Rb1，使其终浓度为0、2、5、10、50、100、120、150、200和250μg／ml，每种浓度3孔，培养12h后，更换成不含药物的培养液继续培养24h，trypsin消化制成细胞悬液，给药组和对照组各取3孔台盼蓝染色计数，计算抑制率。细胞活力测定：取各样本细胞悬液0．9ml加入1%台盼蓝0．1ml，混匀，血细胞计数板盲法计数，着色细胞为死细胞，以活细胞数占计数细胞的百分比反应细胞活力。

1．2．3 时间与药物效应关系实验 同上接种细胞，孵育24h后换液后加入Rb1使其终浓度为50μg／ml，对照组加入等量的DMEM培养液。分别于培养12、24、48、72、96和120h经trypsin消化后台盼蓝染色计数，计算增生抑制率。

1．2．4 MTT 比色法 取密度为4×104／mlRPE细胞悬液200μl接种于96孔板，孵育24h后弃液，加入不含血清含Rb1的培养液，Rb1终浓度分别为10、50、100、120 和 150μg／ml，对照组加 入 等 量DMEM培养液，每组3复孔。培养12h后用培养液漂洗细胞1次，加入5mg／ml MTT（Sigma）10μl和190μl DMEM，继续培养6h，弃液，每孔加入DMSO 100μl，振摇10min，用Bio－RAD550型酶联免疫检测仪在490nm波长下读取吸光值（A值），

进行t检验并计算生存率和EC50。

1．2．53H－TdR掺入法 步骤同1．2．4，Rb1浓度分别为50、100、120、150和200μg／ml，对照组加入等量DMEM培养液，每组3复孔。培养24h后每孔加入1uCi3H－TdR，继续培养12h，Trypsin消化制定细胞悬液，收集细胞于纤维滤膜上，洗涤，凉干后置入闪烁瓶中，加入二甲苯闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟计数值（counts per minute，cpm），进行t检验并计算掺入抑制率。

2 结果

2．1 剂量－效应关系 RPE细胞数随Rb1浓度增加而减少，Rb1在2、5、10、50、100、120、150、200、250μg／ml对细胞增生的抑制率依次为22．70%、36．49%、41．67%、49．43%、76．44%、85．34%、86．49%、85．92%和86．78%。

2．2 时间－效应关系 贴壁生长良好的RPE细胞在给药后12h可见部分细胞脱落，与对照组相比Rb1组在给药后12、24、48、72、96和120小时 RPE细胞 增 生 抑 制 率 分 别 为 18．77%、38．80%、58．89%、71．59%、77．69%和77．33%；于给药后96 h内，其抑制效应随时间而明显增强，各组细胞活力均在90%以上。

2．3 Rb1对RPE细胞增殖的抑制作用 Rb1组A值明显低于对照组（见表1），Rb1对人胚RPE细胞的EC50为44．55μg／ml。

表1 不同浓度Rb1作用下RPE的生存率

2．4 Rb1对RPE细胞DNA合成的抑制作用Rb1组cpm值随药物浓度增加而降低（见表2），DNA合成抑制率增加。

表2 人胚RPE细胞在Rb1作用下DNA合成抑制率

3 讨论

增殖性玻璃体视网膜病变（Proliferative vitreoretinopathy，PVR）被认为是眼内炎症、孔源性视网膜脱离（Retinal Detachment，RD）、外伤、眼内手术后的损伤修复过程，是由多种细胞、生长因子、细胞因子、胶原和细胞外基质相互作用的病理过程。病理学研究表明视网膜色素上皮细胞（RPE）是发生PVR时最重要的细胞，RPE在病理情况下可移行至玻璃体内并在玻璃体内散布、增生、合成胶原及其它细胞基质，并具有成纤维细胞样作用［4］。PVR是引起视力障碍甚至失明的严重眼病之一，是导致RD手术失败的最常见原因。玻璃体手术虽可有效治疗PVR，但术后仍有一些病人复发，最终导致视力丧失，探讨PVR的药物治疗逐渐成为国内外眼科工作者的研究热点。本实验通过细胞计数法、MTT比色法和3H－TdR掺入法探讨Rb1对RPE细胞增生的影响，结果发现Rb1对培养的人胚RPE细胞增生具有抑制作用，在一定时间（96h）和剂量范围内（2μg／ml至200μg／ml）存在时间依赖和剂量依赖关系。我们还发现贴壁生长良好的RPE细胞在给药后12小时即可见部分细胞脱落，贴附是贴附型细胞生长增殖的条件之一，通常细胞表面有由细胞分泌的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞运动尤其是贴附于支持物生长有重要作用［5］。细胞外衣的性质与细胞物质膜电位、酸碱失衡有关，改变细胞外衣的性质可使细胞由支持物上脱落下来。有研究表明RPE细胞中游离钙的浓度调节细胞吞噬功能状态、细胞增殖及细胞与基底膜的粘附力［6］；同时钙离子还是细胞收缩、吞噬、物质转运与代谢及酶活性调节的基础调控者［7］。大量实验证实人参皂甙单体Rb1具有抑制细胞外钙内流降低膜电位［2，8，9］。由此推测Rb1可能通过阻滞钙通道改变细胞内钙浓度引起细胞粘附力、增殖力下降，同时干扰细胞内酶活性和物质代谢；同时通过抑制钙和钠离子内流改变膜电位抑制RPE过度增殖。由于正常活细胞线粒体内活性脱氢酶可将MTT还原为紫色的甲潜（formazan），且细胞的存活数与其产生的甲潜的A值之间存在线性关系。MTT比色法发现给药组细胞甲潜产生量少于对照组，A值明显低于对照组，细胞生存率随药物浓度增加而下降，进一步证实Rb1可干扰细胞代谢。本实验通过3H－TdR掺入实验证实Rb1可抑制RPE细胞DNA合成，其抑制作用在一定浓度范围内药物随浓度的增加而增强。

Rb1可通过抑制DNA合成，并可能通过抑制钙和钠的内流、改变膜电位、干扰细胞代谢、改变细胞外衣的性质而抑制RPE细胞增殖。Rb1作用与人参三醇组皂甙相似，Rb1能否抑制RNA、胶原合成及对PVR动物的治疗作用尚在研究中，Rb1有望成为治疗PVR的有效药物。

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