内皮脂肪酶基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性研究

尹泽黎，刘育进，夏志伟，许宏伟

（1.湖南师范大学湘东医院，湖南 醴陵 412200，2.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410005）

内皮脂肪酶(Endothelial Lipase，EL)是近年被发现的一个脂肪酶家族新成员，具有较高磷脂酶活性，对HDL有较强的代谢作用,它直接或间接参与动脉粥样硬化(Artherosclerosis,AS)的形成,与动脉粥样硬化性脑梗死 (Artherosclerosis Cerebral Infarction,ACI)密切相关。EL基因启动子区域-410位点存在G/A替换单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism,SNP)。研究发现该位点多态性与动脉粥样硬化、冠心病 (Coronary Artery Disease,CAD)、胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)等疾病有关[1,2]。EL-Gly26Ser多态性与脑梗死关系未见报道,我们使用PCR-RFLP技术,检测了湖南地区汉族正常人群和脑梗死患者EL-Gly26Ser基因多态性,旨在探讨其与ACI的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

(1)脑梗死组:收集2009年8月至2011年12月中南大学湘雅医院住院患者,脑梗死组266例(男84例，女 182例)，平均年龄 59.94±10.59岁，患者来源于湖南各地区，均为汉族人，无血缘关系。所有病例均符合全国第四次脑血管疾病学术会议修订的诊断标准,经头部CT及(或)MRI确诊,除外心源性栓塞、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形等原因引起的脑梗死,并排除患有严重肝肾疾病、甲状腺疾病、血液病和最近6个月服用雌激素患者。

(2)对照组:为湘雅医院健康中心体检者,共91例(男 42 例，女 49 例)，平均年龄 53.37±10.23 岁，均为湖南地区汉族人，无血缘关系。排除有冠心病、脑血管病、心脑血管疾病家族史、肝肾疾病、血液病、自身免疫性疾病、妊娠、半年内有过降脂治疗者。对照组和脑梗死组患者年龄、性别相匹配。

1.2 方法

1.2.1 人基因组DNA的提取

取外周静脉血5ml,肝素抗凝,用常规酚/氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 EL-Gly26Ser基因PCR扩增[3]。

引物合成，上游为:5'-TTGCTGGAAACACCAAGAGG-3'.,

下游为:5'-GACCCAGCACAGAGAAGTGG-3'.,反应条件为:95℃预变性5min，94℃变性40s，58.8℃退火 60s，72℃延伸 40s，40 个循环，最后 72℃充分延伸10min。最后置于4℃终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否为目的DNA片段,并对PCR扩增产物纯化。

1.2.3 限制性片段长度多态性(RFLP)分析

取5μl EL-Gly26Ser PCR产物,加Cfr13l限制性内切酶反应体系,37℃水浴消化6～7h,3%琼脂糖凝胶电泳后用Eagle Eye II型凝胶图像分析处理系统观察电泳结果并确定基因型,并对其进行测序。

1.3 统计学分析

通过HWT软件检验Hardy-Weinberg平衡，用SHEsis软件对EL-Gly26Ser基因位点做连锁不平衡及单体型分析。ACI组和对照组的基因型和等位基因频率的比较采用卡方检验，计量资料两组比较采用t检验，两组以上比较采用方差分析，多因素分析采用Logistic回归分析。设显著性检验水准为a=0.05，P值取双侧概率。应用SPSS13.0的统计软件包作统计学处理。

2 结 果

2.1 脑梗死组和对照组的临床特点

ACI组和对照组一般资料、血压、空腹血糖(FBS)以及血脂水平比较见表1，ACI组与对照组相比，年龄和性别构成比无显著性差异(P>0.05)，ACI组高血压病史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史及饮酒史者均多于对照组，有统计学意义 （P<0.05），ACI组收缩压（SBS）、舒张压(DBS)、总胆固醇(TC)、FBS、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平均高于对照组，有统计学意义（P<0.05），ACI组甘油三酯（TG）及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平均低于对照组，有统计学意义（P<0.05）。

表1 ACI组与对照组一般资料及血糖、血脂、血压水平比较（mean±SD）

2.2 EL-Gly26Ser基因多态性分析结果

Gly26Ser的酶切结果见图1。用限制性内切酶Cfr13l酶切PCR产物后只发现两种基因型，有两个条带的（151bp和70bp）为GG型纯合子，有三个条带的（221bp、151bp和70bp）为GA型杂合子。其基因型进行基因测序证实为目的片段，见图2。

对照组中EL基因Gly26Ser多态位点只检测出GG型一种基因型，ACI组中检测出GG型及GA型两种基因型，但均未检测到AA基因型。各基因型频率及等位基因频率见表2-2。经卡方检验，ACI组和对照组Gly26Ser多态位点基因型频率及等位基因频率分布无显著差异（P>0.05）。

图1 EL基因Gly26Ser多态位点Cfr13l酶切结果

图2 Gly26Ser G/A正向测序，为纯合子GG型

表2 ACI组与对照组Gly26Ser基因型和等位基因频率比较

2.3 ACI组Gly26Ser不同基因型与血脂水平的关系

ACI组中，Gly26Ser各基因型之间 TC、TG及LDL-C水平比较均无显著性差异 （P>0.05），见表3。

表3 ACI组Gly26Ser不同基因型血脂水平比较（mean±SD）

2.4 ACI危险因素的Logistic回归分析

将性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、冠心病史、吸烟史、饮酒史、血压、血糖及血脂等脑血管病的危险因素和EL基因Gly26Ser各基因型同时纳入到多因素Logistic回归模型中，采用逐步回归分析方法筛选出与ACI相关的危险因素。以性别 （男=1，女=2），年龄（≥55 岁=1，＜55 岁=0），高血压病史、冠心病史、糖尿病史、吸烟史以及饮酒史（有=1，无=0），收缩压（≥140mmHg=1，＜140mmHg=0）,舒张压（≥90mmHg=1， ＜90mmHg=0），FBS （＞6.1mmol/l=1,≤6.1mmol/l=0），TC(＞5.6mmol/l=1,≤5.6mmol/l=0),TG(＞1.56mmol/l=1,≤1.56mmol/l=0),LDL-C(＞3.19mmol/l=1， ≤3.19mmol/l=0),HDL-C （＞1.76mmol/l=1,≤1.76mmol/l=0)，EL-Gly26Ser基因（GG 型=1、GA 型=2）作为自变量（X），将是否患 CI作为因变量（Y），回归方程似然比检验结果为（X2=277.551，P=0.000），所拟合的Logistic回归模型有统计学意义。以a入=0.05，a出=0.10为标准，纳入ACI回归方程的危险因素包括高血压病史、糖尿病史、吸烟史、TC、LDLC及HDL-C，而EL-Gly26Ser基因多态位点各基因型未进入回归方程，见表4。

表4 ACI危险因素Logistic回归模型

3 讨论

内皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)是近年被发现的一个脂肪酶家族新成员，位于18号染色体q21.1，68kD大小的糖蛋白[4]。 EL磷脂酶活性强，对HDL有较强的代谢作用，而EL主要在血管内皮细胞中表达，小部分由巨噬细胞及平滑肌细胞合成[5]。EL与HDL-C呈负相关，而与动脉粥样硬化形成及代谢综合征呈正相关[6,7]。目前研究已经发现EL基因存在多个单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点，2002 年，DeLemos 等[1]发现6个具有潜在功能的SNP位点，其中4个引起了氨基酸替换 （Gly26Ser，Thr111Ile，Thr298Ser 及Asn396Ser），2个 SNP在 EL基因启动子区域（-410C/G ，-303A/C）。Gly26Ser由 EL的第 26个氨基酸的密码子G突变为A，导致甘氨酸（Gly）突变为丝氨酸（Ser）。

目前研究显示Gly26Ser基因型以纯合子GG型最常见，杂合子GA型次子，纯合子AA型最少，等位基因频率以G等位基因为主，并且多个研究均显示Gly26Ser多为GG、GA两种基因型分布。本实验研究仅检测到GG、GA两种基因型，基因型以GG型为主，等位基因频率以G等位基因为主，与其他研究结果相似。本研究人群的多态性分布符合Hardy-Weinberg平衡，提示本研究人群能够较好的代表湖南地区汉族人群的EL基因Gly26Ser基因型及等位基因频率分布。

DeLemos等[1]发现Gly26Ser多态性位点主要存在于高HDL-C水平的患者中，而在对照组中未见突变位点，提示其与HDL-C水平有关。本研究的对照组中未检出A等位基因，均为GG型，与国外研究类似。而ACI组仅检出6例GA型，未检测出AA型，虽然GA型患者HDL-C水平较GG型高，但ACI组各基因型之间HDL-C水平无显著差异，此与国外研究不同，可能与DeLemos等的研究对象具有较高的选择性有关，其纳入的研究对象HDLC水平较高，可能存在选择偏倚，影响结果的可比性。此外，也有研究显示并不是所有的突变都会导致EL活性的改变[8]。Gly26Ser位点也可能对于中国湖南地区汉族人群属于无功能改变的突变位点。

目前关于EL的研究多集中在EL与HDL-C之间的关系，暂无EL基因与ACI的相关研究。Ma等[9]研究EL基因敲除小鼠时发现，当EL敲除后HDL-C清除率下降了50%，血浆HDL-C水平明显升高，提示EL是HDL-C代谢的关键因素。本研究显示湖南汉族人群存在EL基因Gly26Ser多态性分布，但Gly26Ser基因型及等位基因频率分布在ACI组和对照组之间无显著性差异（P>0.05）。多因素Logistic回归分析也未发现Gly26Ser多态性与ACI存在相关性，提示EL-Gly26Ser基因多态性与ACI之间可能不存在关联性。

脑血管疾病发病机制复杂,EL-Gly26Ser基因多态性是否与脑梗死有关,目前未见研究报道。本研究结果提示中国湖南汉族人群存在EL-Gly26Ser基因多态性;EL-Gly26Ser基因多态性可能与脑梗死无关,该位点可能不是湖南地区汉族人群动脉粥样硬化性脑梗死的遗传易感基因。尚需进一步在不同种族、地域人群中进行大样本临床研究。

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