不同持续时间低氧后运动对大鼠骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达的影响

刘 铭，瞿树林，刘文峰

（湖南师范大学体育学院 湖南 长沙 410006）

低氧诱导因子-1(Hypoxia induced factor-1，HIF-1)由Semenza和Wang在1992年研究中发现[1]，是一种缺氧诱导转录因子，含一个α亚单位和一个β亚单位，分子量分别为120kD和91-94kD[2]。HIF-1α为氧调节蛋白，受氧浓度变化调节；HIF-1β在细胞核内持续表达，不受氧张力的影响。在缺氧条件下，HIF-1α转录活性迅速增加，并与HIF-1β结合形成二聚体，能激活很多缺氧反应性基因，并与相应的靶基因相结合，通过转录及转录后的调控，使机体对缺氧、缺血产生适应反应。目前认为HIF-1α可以作为组织缺氧的标志[3,4]。

本研究探讨低氧训练对骨骼肌HIF-1α表达的影响，骨骼肌HIF-1α的表达与不同低氧训练刺激时间和方式的关系。

1 实验材料与方法

1.1 动物分组

健康雄性的8周龄Spragne-Dawley大鼠，体重180～220g，共30只，常规分笼、以国家标准啮齿类动物饲料饲养（大鼠及喂养的饲料均购于湖南农业大学实验动物学部）。实验条件：自由饮水进食。室温22±3℃，相对湿度50%，光照时间15小时。正式实验前一天称重，按体重分层随机分为3组，运动对照组、低氧8h运动组和低氧12h运动组，每组10只。

1.2 模型制备

本实验采用零坡度跑台的训练方式，以25m/min的速度训练，每天1h。训练完后，将实验组的20只大鼠放入由Hypoxico公司的生产的低氧仓中，并用TOXIRAE PGM-36型氧气监测仪实时监测低氧舱中氧含量的变化，将氧浓度控制为12.5%（相当于4000m海拔高度），过8h和12h后，分别将低氧8h训练组和低氧12h训练组取出。低氧训练共持续4周，每周5天。

1.3 取材

实验结束24h后，采用由军事医学科学院军事兽医研究所提供的速眠新Ⅱ（0.8-1.2mL/kg）腹腔注射，麻醉至理想即断头处死，取出大鼠比目鱼肌，置入4%多聚甲醛中固定，24小时后常规石蜡包埋待进行组织免疫化学指标的测定。

1.4 主要试剂

HIF-1α兔抗大鼠抗体，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，PV试剂盒和DAB显色剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.5 免疫组化染色

采用免疫组织化学法检测比目鱼肌组织中HIF-1α的蛋白表达。将所取组织块切厚为5μm的切片；脱腊、水化组织切片；3%H2O2孵育10min；高压锅抗原修复后室温冷却；滴加1:50的一抗，4℃冰箱过夜；滴加二抗，37℃孵育30min；DAB染色；自来水冲洗；苏木素复染；自来水冲洗；盐酸酒精分色；中性树脂封片。

1.6 结果判定

在光学显微镜（×400）下观察大鼠比目鱼肌细胞，每张切片随机观察6个视野，应用北航MIAS医学图像分析系统计算每个视野中HIF-1α蛋白表达的阳性细胞数量。光镜为德国LEICA公司产的LEICA DM LB2型双目显微镜，Motic B5显微摄像系统产自麦克奥迪实业集团公司。

1.7 统计处理

所有数据采用平均值±标准差表示。采用单因素方差分析，显著性水平取α=0.05。所有数据均用SPSS 12.0统计学软件分析。

2 结果

运动对照组、低氧8h运动组和低氧12h运动组大鼠比目鱼组织可见不同数量的HIF-1α阳性表达，其阳性表达随着低氧时间的延长增加，以低氧12h运动组表达最高。

表1 不同持续时间低氧后运动对大鼠骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达

HIF-1α蛋白的表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状。HIF-1α免疫组织化学阳性物质定位于细胞核内,呈弥散或颗粒状或二者混合。运动组骨骼肌组织中可见HIF-1α免疫阳性物质 （图1①）；低氧8h运动组HIF-1α免疫阳性颗粒位于细胞核中,较运动组的表达较上有所增加（图1②）；低氧12h运动组骨骼肌组织中有较多的阳性反应物质（图 1③）。

图1 大鼠比目鱼肌HIF-1α蛋白表达

3 讨论

自1968年墨西哥奥运会[5]“低氧训练”被提出至今，这种训练方法在竞技体育中已经得到广泛的应用。低氧训练的研究始于血液成分[6]的研究，之后关于心脏功能[7]、肺通气量[8]、骨骼肌代谢[9]等的研究都证明，低氧训练能提高机体转运和利用氧的能力。目前，许多研究者力图从细胞和分子水平阐述低氧训练对机体的影响，并逐步成为一个新的研究方向。

HIF-1是由120ku的α亚基和91-94ku的β亚基组成的异二聚体，两者都属bHLH-PAS家族蛋白[10]。HIF-1在正常细胞内含量很少，在低氧条件下含量显著升高，其原因可能与HIF-1在正常条件下迅速降解有关。HIF-1的蛋白稳定性和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节[11]。HIF-1作为一种转录因子，低氧时在组织细胞中广泛表达，它和低氧反应有关基因结合位点结合，共同介导低氧反应，至今已发现近30个可被HIF-1转录激活的靶基因[12]，如促红细胞生成素[13]、内皮生长因子[14]、葡萄糖转运因子-1[15]等，这些基因均含有一个低氧反应性元件及cis作用转录调节序列。

HIF-1α是HIF-1所特有的受低氧调控的亚基，低氧状态下HIF-1α蛋白增加，转移至核，与HIF-1β结合成二聚体复合物HIF-1，参与一系列低氧反应基因的转录调节[16,17]。HIF-1α在机体组织缺氧条件下对维持内环境的平衡起着重要的调节作用[18]。 张楠等认为低氧训练中腺苷酸活化蛋白激酶 （5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）α2对骨骼肌HIF-1α mRNA表达起重要作用[19]。

低氧力竭运动能诱导的HIF-1α基因表达，低氧持续时间超过3－5天，HIF-1α基因表达仍持续升高[20]。郑澜等21]研究结果说明低氧和运动训练，可增加骨骼肌组织HIF-1α蛋白和VEGF mRNA含量，低氧训练骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达的增加，对VEGF基因转录具有促进作用。Hoppeler[22]发现未经训练的健康人在低氧状态下进行6周耐力训练后，骨骼肌HIF-1α mRNA出现明显的上调，并导致内皮生长因子mRNA、肌红蛋白mRNA表达的增加，但HIF-1α mRNA表达增加不依赖于运动训练的强度。Vogt等[23]结果发现成年男子在模拟3850m海拔蹬功率自行车6周低氧训练后，HIF-1α mRNA表达升高，反映出对低氧训练的持久适应性，同时证明HIF-1α mRNA与训练强度无关。

在前人的实验结果基础上，我们对不同持续时间低氧后运动对大鼠骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达的差异进行研究，发现HIF-1α蛋白的表达与低氧刺激的持续时间呈相关。说明骨骼肌组织细胞在受到低氧刺激时，具有时效性、程度和方式的差异特，表明利用低氧作为运动员的一种机能刺激，控制低氧暴露的程度与时间，能达到生理性适应的目的，并能一定程度的起到保护作用，提高机体有氧代谢和无氧代谢能力。

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