氯喹对大鼠全脑缺血／再灌注后学习能力的影响

陈 伟 崔桂云△ 王小鹏 赵秋宸 黄晓雷 花 放 沈 霞

1）徐州医学院神经病学教研室 徐州医学院附属医院神经科 徐州 221000 2）徐州医学院临床医学系 徐州 221000

急性缺血性脑卒中是一种当前严重危害人类健康的疾病，占全部脑卒中患者的60%～80%。早期实现缺血区血流复灌是治疗的关键，但在实现再灌注后有部分患者出现神经功能损伤加重，被称为缺血／再灌注损伤，并往往带来患者认知功能的损害。目前已证实缺血部位的炎症反应参与缺血／再灌注损伤的病理生理机制［1－2］。氯喹可以通过下调免疫细胞产生炎性因子水平达到抗炎作用，现已有研究表明氯喹可以抑制脑缺血部位的炎症反应，但对缺血后学习能力的影响尚未见报道，本实验将探讨这一问题。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组SD雄性清洁级大鼠，体质量250～300g，购自中国科学院上海动物中心，随机分为假手术组（S组）、缺血／再灌注组（I／R组）与氯喹处理组（C组），每组12只。

1.2主要试剂及设备氯喹（美国sigma公司），HE染色试剂盒（碧云天生物技术研究所），Y型电迷宫由张家港生物医学仪器厂生产。

1.3 SD大鼠全脑缺血模型的建立按Pulsineli方法制作大鼠四血管阻塞模型，实验动物随机分为假手术组、缺血／再灌注组（I／R）组和氯喹处理组。I／R组以10%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后电凝双侧椎动脉，术后第2天在大鼠清醒状态下分离出双侧颈总动脉，动脉夹夹闭15min，再灌注72h后处死；假手术组处理同缺血／再灌注组，但不夹闭双侧颈总动脉；氯喹处理组处理同缺血／再灌注组，但在夹闭颈总动脉前2h腹腔注射氯喹（60mg／kg）。

1.4组织切片的准备假手术组大鼠在分离颈总动脉后72 h，缺血／再灌注组与氯喹处理组大鼠于再灌注72h时间点暴露心脏，经左心室插入导管至升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注37℃生理盐水100～150mL冲净血液，再灌注4℃4%多聚甲醛固定液250mL，其中前1／3快速灌注，后2／3慢滴，共在30～40min内灌注完毕；然后断头取脑，以视交叉和乳头体后缘为界线取包含海马的脑组织放入4%多聚甲醛后固定48h，常规石蜡包埋，用切片机作连续脑冠状切片（片厚6μm）。

1.5 HE染色步骤HE染色过程按照染色试剂盒提供的实验步骤使用苏木素及伊红进行染色，光镜下观察海马部组织结构及细胞形态。

1.6行为学检测训练及评定方法：Y型电迷宫，电刺激参数：电压50～70V，电流强度017mA，电击延时5s。（1）筛（预）选：将大鼠放入Y型迷宫箱中适应3～5min后，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃、对电击反应较敏感、逃避反应迅速者供测试用。（2）学习记忆测试：采用固定次数随机不休息法，以大鼠在足底通电后10s内一次性进入安全区的反应为正确，否则为错误反应。每次实验对每只大鼠分别进行测试，连续10次测试中有9次或以上正确反应（行为正确率≥90% ）为达到学会标准，以每只大鼠达到学会标准所需次数表示大鼠的学习记忆成绩，平均达标所需的次数越多，表示达到学会标准所需时间越长，则表明动物学习、记忆成绩下降。各组在造模后72h分别予以Y型迷宫测试其学习记忆能力。

1.7统计学分析实验数据均采用SPSS16.0统计分析软件进行统计学处理数据以均数±标准差（s）表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果HE染色结果如图1所示，假手术组大鼠海马结构完整，细胞排列整齐紧密，细胞核完整。缺血／再灌注组大鼠海马神经元排列杂乱，细胞结构崩解。氯喹处理组大鼠海马虽然部分组织结构散乱，但整体损伤程度轻于损伤组大鼠。见图A～图F。

2.2行为学测定结果假手术组、缺血组、氯喹处理组Y迷宫测试达标次数分别为（34.33±5.57）次、（67.67±8.52）次、（55.5±6.22）次。结果显示缺血／再灌注组大鼠达到学会标准次数明显较正常组和氯喹处理组大鼠高（P＜0.05），氯喹处理组大鼠达到学会标准的次数高于假手术组大鼠（P＜0.05）。

3 讨论

早期实现缺血区域的血流灌注是急性缺血性脑卒中的最有效治疗措施，但缺血／再灌注损伤却加重病情进展，其具体病理生理过程至今仍不明确。近年来缺血区域的炎症反应引起研究人员的注意，免疫细胞的活化与募集［3］，各种炎性因子的释放［4－5］都可以加重组织损伤。近年来氯喹作为免疫调节药物被广泛应用于自身免疫病的治疗，在最新研究中证实氯喹能够抑制溶酶体功能并协同性地激活糖皮质激素信号，进而通过激活的糖皮质激素信号进一步抑制炎症基因转录，降低炎症因子水平，从而实现抑制炎症的目的［6］。现已明确氯喹可以抑制单核巨噬细胞系统产生肿瘤坏死因子α与白介素6［7－8］，而这两种细胞因子恰恰是急性脑缺血损伤程度的重要标志，均可以加重脑缺血后的炎症损伤。我们认为氯喹在血脑屏障被缺血性损伤破坏后，在脑内可达到较理想的血药浓度并通过下调缺血区域炎性因子的水平抑制炎症细胞的活化与浸润，阻止了炎症级联反应的发生与发展，减轻了缺血区的二次损伤，保护了半暗带区残存神经细胞，有效改善预后。

海马结构是脑内对缺血缺氧刺激尤为敏感的部位，同时也是脑内重要的参与学习与记忆能力形成的部位，本实验中我们采用HE染色方法对海马部进行染色观察不同组大鼠海马部的形态，结果表明氯喹处理组大鼠和缺血损伤组相比，海马部细胞损伤情况明显改善，细胞排列整齐且细胞结构完整。这提示在脑缺血模型中使用氯喹可能会在缺血脑组织中发挥其免疫调节作用，减轻了缺血组织的炎症损伤，达到保护神经元的目的。我们进一步使用Y形电迷宫对各组大鼠学习及记忆能力进行测定，结果证明虽然氯喹处理组大鼠达标次数多于假手术组，但却明显少于缺血／再灌注损伤组大鼠。这一结果提示可能因为氯喹减轻脑组织损伤从而较为完好的保存认知功能。

本实验通过对脑组织形态的观察及对大鼠学习能力的测试，证实氯喹可以对大鼠脑缺血后学习能力的保留产生积极影响，这可能是由于在脑缺血后血脑屏障受到破坏，使氯喹可在脑内达到合适的血药浓度，通过抑制海马结构的炎症反应进而减轻组织损伤，达到维持神经功能的作用。但氯喹在缺血再灌注损伤中的具体作用机制仍有待深入研究。

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