某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析＊

杨 辉，张国良，张明霞，陈心春，陈建波，吴爱武

（1.广州医学院医学检验系 510182；2.广东省深圳市第三人民医院肝病研究所 518112；3.广州医学院第一附属医院检验科 510120）

某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析＊

杨 辉1，2，张国良2，张明霞2，陈心春2，陈建波2，吴爱武3△

（1.广州医学院医学检验系 510182；2.广东省深圳市第三人民医院肝病研究所 518112；3.广州医学院第一附属医院检验科 510120）

目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点。方法60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统（BACTEC－MGIT960）进行鉴定和药敏分析。在这60株菌株中，针对包括利福平耐药决定区（RRDR）在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA－15、kasA269、kasA312进行PCR扩增，并将扩增产物T－A克隆后进行测序。结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中，检出利福平耐药株45株，敏感株15株；异烟肼耐药株41株，敏感株19株；利福平和异烟肼同时耐药的有14株。在45株利福平耐药株中，rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%（41／45），共检测到12种突变形式，主要突变位点在531、526、516、533，以Ser531Leu突变最常见，占rpoB发生基因突变株的51.2%（21／45）。在41株异烟肼耐药株中，katG315位点有29株发生突变，包括28株katG315（AGC－ACC）和1株katG315（AGC－AAC）突变，突变发生率为70.7%（29／41）；inhA－15位点有9株发生突变，均为（C－T）突变，突变发生率为21.95%（9／41）。kasA基因未发现常见突变形式。结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致，但各位点频率有所不同。

分枝杆菌，结核；药物耐受性；突变

结核病是严重危害人们身体健康的重大公共卫生问题，根据世界卫生组织（WHO）报告，全球将近1／3的人口曾经或正在感染结核分枝杆菌，每年约900万人发展为活动性结核病，近300万人会发展成为耐多药结核病，并有180万人死于该病。耐多药结核病是指至少同时对两种主要临床一线药物利福平和异烟肼都耐药的结核病［1］。本研究通过基因测序来分析结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA启动子、kasA的突变情况，探讨结核分枝杆菌耐药的特点，为建立快速检测结核分枝杆菌药物敏感性的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA由香港大学微生物实验室馈赠。60株结核分枝杆菌临床分离株来源于2010年8月至2011年8月深圳市第三人民医院住院的危重结核患者。

1.2 仪器与试剂 采用全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统（BACTEC－MGIT960）、高速离心机、恒温箱、Qiagen公司的基因提取试剂盒、Axygen公司的PCR产物纯化试剂盒、Takara公司的PCR反应试剂（DRR006B）和T载体试剂盒（D101A）。

1.3 方法

1.3.1 检测方法 实验完全按照全国结核病细菌学检验标准化规程进行，标本在Middlebrook7H9结核分枝杆菌液体培养基中培养。并用全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统进行检测。

1.3.2 细菌DNA的制备 吸取1mL培养阳性的 Middlebrook7H9结核分枝杆菌液体培养基，在100℃恒温箱中温浴30min进行灭活，然后使用Qiagen公司的细菌基因提取试剂盒进行核酸抽提，操作按其说明书进行。

1.3.3 目的基因扩增 针对rpoB基因的RRDR、katG315、inhA启动子区－15位点和kasA基因269和312位点进行设计引物，引物由深圳凯杰生物公司设计，上海生工公司进行合成，引物设计见表1。

表1 目的基因扩增所用的引物序列及长度

1.3.4 PCR检测 PCR反应体积为50μL，其中DNA 2μL，Ex Taq酶2U，引物各20μmol，dNTP混合液4μL，10×Ex Taq缓冲液5μL，其余由蒸馏水补足。扩增条件为:95℃变性10min；95℃30s，58℃20s，72℃20s共30个循环；72℃维持10min。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。使用AxyGen公司的PCR产物纯化试剂盒进行核酸纯化，操作按照说明书进行。使用Takara公司T载体试剂盒，操作按说明书进行，将纯化好的核酸转入T载体后转化到感受态细胞，并在LB固体培养基上进行蓝白斑筛选培养。挑选LB固体培养基上白色单克隆菌落，进行菌落PCR验证为阳性克隆后送到华大基因公司进行测序。测序结果与结核分枝杆菌H37Rv标准株进行比较分析。

2 结 果

2.1 全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪器检测结果 在被检测的60株标本中，利福平耐药株45株，敏感株15株；异烟肼耐药株41株，敏感株19株；利福平和异烟肼同时耐药的有14株。

2.2 PCR扩增产物电泳结果 见图1。

2.3 rpoB基因检测突变的结果 目的基因被扩增的片段为488 bp，rpoB包含了81bp的利福平耐药决定区（RRDR）。RRDR在60个菌株中检测结果（表2），15株敏感株均未发生突变。45株利福平耐药株中有41株存在rpoB突变，即91.1%（41／45）的利福平耐药菌株存在rpoB突变。在这41株rpoB突变株中发生单一突变的菌株有32株，多突变位点重合突变的有8株，1株出现rpoB基因510和511位点缺失。其中最易发生突变的位点为531位点，突变率为51.2%（21／41）；其次为526、516位点，这3个位点共占rpoB基因突变的82.9%（34／41），测序结果见图2。

2.4 katG基因检测结果 41株存在katG基因突变，其中24株为单个点突变，15株存在联合突变，2株存在插入序列。在24株单点突变中，有17株为katG315（AGC－ACC）突变，1株为katG315（AGC－AAC）突变。在15个联合突变中有11个存在katG315（AGC－ACC）突变，结果表明在异烟肼耐药株中，katG315位点突变的发生率为70.7%（29／41），其余总共25种突变形式暂未发现其突变作用。

2.5 inhA启动子区基因检测结果 9株结核分枝杆菌存在inhA基因启动子－15位点C－T突变，占异烟肼耐药株的21.95%（9／41），其他还存在11种不同突变。

图1 结核分枝杆菌H37Rv标准株rpoB、katG、inhA和kasA基因扩增结果

表2 RRDR基因突变情况

图2 常见位点测序结果

2.6 kasA基因检测结果 存在23种突变，均为单碱基突变，未发现常见突变269突变和312突变。

3 讨 论

利福平和异烟肼是治疗结核分枝杆菌感染的首选药物，特别是在短期治疗中起到重要的作用。耐多药结核的产生给患者治疗带来更大困难，包括治疗费用增加、治愈率下降、病死率增高等。目前，结核病的控制情况不容乐观，相关保障措施不够，耐药结核病的控制亟待开展，诊断耐多药／广泛耐药结核病还面临很大的挑战［2］。针对日益严重的结核病疫情，早期鉴定结核耐药已成为迫切需要。利用培养的方法进行结核菌药敏试验是临床分离结核分枝杆菌药物敏感性的标准方法，但由于其培养周期太长，不能及时满足临床治疗的需要，因此检测结核分枝杆菌对常用抗结核药物的耐药位点突变情况，是快速了解结核分枝杆菌对常用抗结核药物是否敏感的重要途径。

本研究发现，结核分枝杆菌rpoB基因发生突变是利福平耐药的主要原因，突变主要发生在RRDR，这一区域中不同位点突变的频率不同，其中主要以531、526和516为主［3－6］。rpoB基因是细菌RNA聚合酶的β亚基的编码基因，当RRDR突变时，DNA依赖的RNA聚合酶B亚单位结构发生改变，从而发生耐药［7］。本研究结果表明，15株敏感株在rpoB中均未发生突变，45株耐药株中有41株在rpoB发生了突变，共有12种突变形式，其中最主要的突变形式Ser531Leu（51.2%），其次为526、516、533等密码子突变。在41株突变菌株中，32株为单碱基突变，7株为双碱基突变，1株3个碱基突变，1株出现510和511位点缺失，主要以单点突变为主。本研究与2010年报道的广东地区rpoB基因突变的结果相似，说明快速检测这些位点是否存在突变可作为判断结核分枝杆菌是否对利福平耐药的依据［8］。但本次测序结果有1株结核分枝杆菌出现了510和511的缺失，说明rpoB基因RRDR可能不是结核分枝杆菌生存所必须。与国外报道相比，531的突变频率有所降低。各地rpoB基因位点突变频率的不同，可能与当地结核病的传播途径和进化有关。

本研究选取异烟肼常见耐药基因突变进行检测，探讨其在深圳地区耐药相关基因的突变特点。异烟肼主要通过抑制结核分枝杆菌分枝菌酸的生物合成，导致细菌细胞壁破损，从而杀灭细菌。异烟肼的耐药机制非常复杂，涉及katG、inhA、oxyR－ahpC、kasA和ndh等基因［8］。根据国内外报导，katG315位点和inhA－15位点占异烟肼耐药的80%以上［9－11］。在本次测序结果中，共有29株存在katG315突变，其中包括28株katG315（AGC－ACC）和1株 katG315（AGC－AAC），9株存在inhA－15（C－T）突变，同时存在katG315和inhA－15位点突变的共有3株，但是本研究并未发现已有文献报道的katG279位点突变和inhA－8位点突变［12－14］。同时本次测序未发现kasA基因常见突变位点kasA269和kasA312突变，说明在深圳地区由于kasA基因突变导致异烟肼耐药的发生频率较低，或也不排除是因为样本量较少或者抽样原因导致。

本研究采用基因测序的方法来分析结核分枝杆菌临床分离株对利福平和异烟肼耐药基因的特点，为建立快速检测结核分枝杆菌耐药基因提供实验室依据。

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The characterization of gene mutation in rifampin and isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolated from a city＊

Yang Hui1，2，Zhang Guoliang2，Zhang Mingxia2，Chen Xinchun2，Chen Jianbo2，Wu Aiwu3△（1.Department of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical College，Guangzhou，
Guangdong510182，China；2.Liver Disease Research Institute，the Third People＇s Hospital of Shenzhen，Shenzhen，Guangdong518112，China；3.Department of Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou，Guangdong510120，China）

ObjectiveTo investigate the characterization of gene mutation in Rifampin and Isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis isolated from Shenzhen.Methods60Mycobacterium tuberculosis clinical strains were identified and their drug resistance in phenotype were tested by BACTEC MGIT960，rpoB，katG315，inhA 15，kasA269and kasA312genes were amplified by PCR and the fragments were cloned into T vector and sequenced.ResultsAmong the 60Mycobacteria tuberculosis clinical strains，45rifampicin resistant strains and 15rifampicin susceptible strains；41isoniazid resistant strains and 19isoniazid susceptible strains；14multiple drug resistance strains were detected.About 91.1%（41／45）of Mycobacterium tuberculosis isolates in 45rifampicin drug resistant strains has mutations in rpoB and there were 12different mutations，gene locus 531、526、516、533mutation had a higher frequency especially gene locus 531which had 51.2%（21／41）of mutational rate in 41strains with rpoB gnen mutation.Point mutations at gene locus katG315including katG315（AGC－ACC）in 28isoniazid resistance strains and katG315（AGC AAC）in 1isoniazid resistance strain，were found in 70.7%（29／41）of isoniazid resistant strains.21.95%（9／41）of Mycobacterium tuberculosis isoniazid resistant strains had inhA－15（C－T）mutations，no mutation in kasA was found in the study.ConclusionOmpared with other studies，the mutational gene site of Mycobacterium tuberculosis isolates with drug esistance of rifampicin and isoniazid in Shenzhen were consistant，but the gene mutation frequency in common gene locus of drug esistance were different.

mycobacterium tuberculosis；drug tolerance；mutation

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.006

A

1671－8348（2012）34－3591－03

国家自然科学基金资助项目（81172732）。 △

，Tel:13660281744；E－mail:aiwwu66＠163.com。

2012－06－09

2012－08－22）