电针对吗啡戒断大鼠学习记忆和VTA脑区CaMKⅡ含量的影响

孙远征,王明明,卫哲,马俊

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

电针已成为戒毒的有效治疗方法,中脑边缘多巴胺系统(MLDS)参与成瘾机制,是与学习、记忆、情感及行为学相关的重要结构。药物成瘾可对成瘾者的学习记忆能力造成一定损害[1]。研究证实 Ca2＋-CaM-CaMK信号转导通路在吗啡成瘾中起到重要作用[2],本实验采用水迷宫训练来观察电针对吗啡戒断大鼠学习记忆的改善,并从中脑VTA水平检测CaMKⅡ的活性,深入研究电针抗吗啡戒断的中枢神经系统机制。

1 材料和方法

1.1 实验对象与分组

雄性SD大鼠48只,体重(190±30)g,清洁级,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供,适应性喂养 1星期后随机分组,分为生理盐水对照组(对照组),吗啡戒断模型组(模型组),电针治疗组(电针组),艾灸治疗组(艾灸组),共4组,每组12只。

1.2 试剂和仪器

盐酸吗啡(沈阳第一制药厂),盐酸纳洛酮(成都倍特药业有限公司),戊二醛(上海生物工程有限公司),多聚甲醛(分析纯,上海溶剂厂),免疫组化检测试剂盒(PV-6001)(北京中杉金桥生物技术有限公司);KWD808Ⅱ脉冲治疗仪,Morris水迷宫。

1.3 造模

参考相关文献[3]进行造模,除对照组外,每组采用逐日递增法连续5 d背部皮下注射吗啡,建立吗啡依赖大鼠模型,每日 2次(8 Am、4 Pm),每日剂量为 20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg。末次注射吗啡后3 h腹腔注射纳洛酮(3 mg/kg)快速戒断,立即将大鼠置于 3000 mL大烧杯中,记录 10 min内大鼠的湿狗样抖动、站立、扭体、洗脸等次数以及齿颤、上睑下垂、激惹和体重下降等不可数戒断症状反应,戒断症状反应参照 Maldonade[4]的方法,根据评分标准进行评分,与已建立的吗啡戒断大鼠模型标准比较,确定模型建立成功。

1.4 实验处理

上述戒断模型建立后次日进行处理,穴位按照林文注《实验针灸学》[5]取大鼠百会、大椎,双侧肾俞、三阴交及足三里穴。

电针组给予大鼠捆绑固定,针刺上述穴位,连接电针治疗仪,采用疏密波,频率 2/100 Hz,连接足三里及三阴交,以大鼠的下肢轻微抖动为度,每次 15 min,每日1次,连续治疗6 d。

其余三组在相同时间相同方法捆绑固定,艾灸组在上述穴位给予艾条灸法治疗。

1.5 Morris水迷宫检测大鼠学习记忆

参考相关文献[6],水迷宫测试分为两个阶段,第一阶段是从治疗的第1、2日进行水迷宫定位航行训练,每日4次,实验前将大鼠置于站台上适应10 s,随机将大鼠从不同象限置入池内,登上站台5 s后终止记录,最长记录 60 s,60 s内不能上台的让其登上站台适应10 s,第3、4、5日开始测试,测量各组平台逃避潜伏期以评判大鼠的空间学习能力;第二阶段是治疗第6日将平台撤除进行空间探索实验,将大鼠从远离靶象限入水,记录60 s内跨越平台次数以评判大鼠的空间记忆能力。

1.6 CaMKⅡ含量的测定

实验结束后每组大鼠立即麻醉,左心室插管灌入生理盐水、4℃的 4%多聚甲醛灌注固定。断头取脑置于4%多聚甲醛中进一步固定,石蜡包埋后行VTA脑切片,片厚6 mm。采用免疫组化PV二步法,按照试剂盒步骤操作。最后采用图像分析系统对切片进行摄片,测定VTA脑区CaMKⅡ的平均光密度,进行实验分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,数据用均数±标准差表示,采用方差分析,P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠吗啡戒断症状评分比较

除对照组外,其余各组大鼠均出现湿狗样抖动、站立、跳跃、洗脸、齿颤、上睑下垂、激惹等症状,并伴有不同程度的体重下降。而对照组无明显戒断反应,与之比较,模型组、电针组及艾灸组有明显戒断反应(P＜0.01),表示大鼠吗啡戒断模型建立成功。详见表1。

表1 各组大鼠吗啡戒断症状评分比较 (x ±s,分)

2.2 各组大鼠Morris水迷宫的测试结果比较

在定位航行实验中,对照组、电针组及艾灸组的平均潜伏期与模型组比较明显缩短(P＜0.01),提示其空间学习能力明显改善;电针组和艾灸组比较差异有统计学意义(P＜0.05),提示电针组优于艾灸组。详见表2。

表2 各组大鼠平均潜伏期的比较 (x±s,s)

在空间探索实验中,对照组和电针组与模型组比较,穿台次数均显著增加(P＜0.01),艾灸组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05),电针组和艾灸组比较差异有统计学意义(P＜0.05),提示空间记忆改善,电针组疗效明显。详见表3。

表3 各组大鼠总共穿台次数的比较 (x ±s,次)

2.3 各组大鼠CaMKⅡ的免疫组化结果比较

对照组、电针组及艾灸组CaMKⅡ的平均光密度值均明显高于模型组(P＜0.01),提示在治疗后VTA脑区内 CaMKⅡ的活性明显增加;电针组与艾灸组比较差异有统计学意义(P＜0.05),提示电针组优于艾灸组。详见表4。

表4 各组大鼠海马区CaMKⅡ的含量比较 (x±s,mg/L)

3 讨论

吗啡成瘾被认为与学习记忆有关,成瘾本身是一种记忆的同时又影响另一种记忆过程[7]。曾燕等[1]证实电针对吗啡戒断后大鼠的学习记忆有明显恢复作用,然而是通过什么机制来改善损害后学习记忆功能尚不十分清楚。本实验通过建立吗啡戒断模型,给予电针治疗、定位航行和空间探索训练以及中脑VTA脑区的活性表达检测。有研究证明在采用Morris水迷宫空间探索实验中采用第1次从远离靶象限入水的成绩作为评价指标来检测大鼠的空间记忆能力得到比较合理的结果[8]。

中医学认为阿片类成瘾机制是烟毒内蕴、各脏腑气血阴阳失衡,主要与肝、肾、脾有关[9，10]。选取百会、大椎、肾俞、足三里、三阴交各穴共同调节各脏腑的阴阳平衡。MLDS是一种主要涉及多巴胺、阿片肽、CaMK等不同递质及受体的系统。阿片类物质作用于该系统,使其各功能和结构发生改变,导致用药者产生强迫性用药和渴求状态,因此认为成瘾是一种慢性复发性脑病[11],针刺是一种有效的中枢神经系统的刺激形式,电针戒断安全、可靠。研究证明2 Hz频率电针可以促进中枢神经系统释放脑啡肽,100 Hz频率释放强啡肽,CaMKⅡ是突触后致密物的主要成分,长期给予吗啡,中脑和海马内 CaMKⅡ活性和激酶含量明显下降[12],吗啡成瘾影响学习记忆可能是通过改变细胞内 Ca2＋浓度,降低依赖于 Ca2＋的 CaMKⅡ蛋白活性而损害记忆,有相关海马内 Ca2＋-CaMK与吗啡戒断后学习记忆影响的研究,本实验从中脑VTA水平观察CaMKⅡ的含量表达与学习记忆的关系。

由于关于针灸对吗啡戒断大鼠学习记忆能力的研究尚处于初级阶段,随着研究的进展,可以在大样本实验研究的基础上进一步阐明阿片类物质成瘾的中枢机制,通过阻断与成瘾有关的学习记忆过程来治疗成瘾以及防止复吸提供可靠的理论基础。

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