针灸对帕金森小鼠模型运动机能调节的分子机制研究

黄 庆 孙艳红 王 璐 张 一 诸 颖 李晓明 孔华庭 王少朋 胡 钧 樊春海

(中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 201800)

针灸早在公元前 2000年就成为一种防治疾病的手段，是以针刺或艾灸身体的穴位，并通过全身经络的传导，来调理气血和脏腑功能，从而达到治病防病的目的。相对于药物来说，针灸具有疗效好、操作简单、副作用低的优势。为什么对机体特殊部位(穴位)进行这种针刺或热疗就能防治疾病, 是一直以来都比较受关注的课题，尽管穴位和经络的本质问题都还在探索之中，还处于假说的验证阶段，但是针灸的临床效果在国际上有目共睹，在20世纪70年代末针灸作为一种治疗疾病的手段，相继得到了世界卫生组织(WHO)和美国国立卫生研究院(NIH)的肯定和认可，尤其在缓解疼痛，改善偏瘫后遗症等运动障碍有较好的临床疗效。

帕金森病(Parkinson disease，PD) 又名震颤性麻痹，是中老年人常见的神经系统退行性疾病[1]。其主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元进行性变性丢失，纹状体区多巴胺含量减少，以及残存的多巴胺能神经元内形成以a-突触共核蛋白(a-syn)为主要成分的嗜酸性包涵体—路易小体(Lewy body，LB)生成为主要的病理特征[2-5]。近年来临床研究证实, 采用头针、体针等方案治疗针灸可以有效改善帕金森病的震颤、肌肉僵直、运动障碍等症状，实验研究发现针灸可以改善MPTP导致的PD小鼠模型的运动协调性，增加中脑黑质内多巴胺能神经元数量，提高了脑内多巴胺的利用率[6-9]，2007年的Nature news专门有篇关于针灸治疗PD的报道，提示针灸在PD的防治中具有较好的应用前景。针刺远端肢体的穴位，能够缓解 PD这种脑部病变引起的症状，其分子机制一直受到极大的关注。本工作利用MPTP腹腔注射建立PD模型，并探讨针灸对其运动机能的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

MPTP、Lamp1、a-synuclein一抗、二抗购于Sigma，华佗牌针灸针，规格0.19 mm ´10mm，华佗牌针刺手法诊疗仪，型号 SXDZ-100，中国苏州医疗用品厂有限公司；BCA蛋白测定试剂盒，碧云天生物技术有限公司。电泳仪，BIO-RAD。

1.2 动物

ICR小鼠，雄性，体重28–30g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2007-0005。

1.3 实验方法[6-9]

1.3.1 分组及治疗

小鼠适应性饲养1周，随机分为生理盐水组，MPTP组，针灸治疗组。针灸穴位选取阳陵泉（GB34）穴，用针刺手法针疗仪进行捻转手法刺激，连续15s。生理盐水组和MPTP组在实验第1天开始分别腹腔注射生理盐水和MPTP (30mg/kg)，每天1次，连续5天，在每次注射MPTP后2h针灸治疗。

1.3.2 旋棒仪进行行为学检测

于试验第5天，针灸治疗后30min，用旋棒仪进行行为学测试，转速为 20r/min，测定前训练 3次，记录在2min内第1次掉落的时间(潜伏期)，超过2min以2min计。

1.3.3 透射电镜标本取材及固定

MPTP停止注射后继续针灸7天，于末次治疗后30min，每组取1只小鼠进行心脏灌注，将针头插入左心室，先缓慢推注30mL生理盐水，然后再快速推注20mL 4%多聚甲醛固定液，然后用小鼠脑切片模具取中脑黑质部位，切成1mm3的小块放入2.5%的戊二醛固定液，送透射电镜观察。

1.3.4 western blot蛋白样品取材

小鼠脱颈椎处死，取中脑黑质部位放于液氮保存，次日取出进行蛋白裂解，测定蛋白浓度后，进行 western blot 检测 Lamp1、a-synuclein的蛋白表达。

2 实验结果

2.1 小鼠模型的构建及针灸的治疗效果

对小鼠的针灸如图1所示。小鼠在注射MPTP后 1h左右出现活动减少，竖毛、竖尾等表现，在注射 3天后就开始出现轻度的静止性震颤, 运动协调性下降。

图1 对小鼠GB34穴位进行针灸处理Fig. 1 Acupuncture treatment at acupoint GB34 in mice.

图2 为注射MPTP 5天后用旋棒仪进行的行为学测试结果，生理盐水组大多数都在 120s以上，MPTP组在棒上时间明显减少，大部分在10s以内，而针灸治疗组掉落潜伏期较MPTP组明显延长，说明针灸可以改善MPTP导致的帕金森模型小鼠运动的协调性。

图2 针灸GB34穴位对帕金森模型小鼠行为学的影响Fig.2 Effect of acupuncture treatment on motor function in Parkinson’s disease mice model.

2.2 中脑黑质Lamp1、a-synuclein蛋白表达

取中脑黑质后进行蛋白裂解，分别对Lamp1、a-synuclein蛋白表达情况进行了western blot检测，结果见图3。与生理盐水组比较，注射MPTP组的溶酶体膜蛋白Lamp1的表达明显下降，a-synuclein蛋白的表达上升，提示MPTP引起的小鼠黑质致密部的溶酶体膜破坏导致了清除a-synuclein的能力下降。针灸GB34穴后，可以增加溶酶体膜蛋白的表达，减轻 MPTP对溶酶体膜蛋白的损伤，促进a-synuclein蛋白的有效降解。结果提示针灸可能能通过改善溶酶体的功能，从而促进了a-synuclein蛋白的降解。众所周知，蛋白酶体和自噬系统是清除缺陷蛋白的两大重要途径，由针灸引发的a-synuclein蛋白降解很有可能是来自自噬水平的上升所致。

图3 针灸GB34穴位对帕金森模型小鼠黑质Lamp1、a-synuclein蛋白表达的影响Fig.3 Effect of acupuncture treatment on protein expression of Lamp1 and a-synuclein.

2.3 针灸对PD小鼠模型黑质超微结构的影响

对各组小鼠黑质的电镜结果发现：正常对照组核膜完整，线粒体结构完整，细胞质中细胞器结构清晰，溶酶体结构完整；MPTP组出现核膜破损，核质弥散，有边集情况，线粒体肿胀空泡化，溶酶体数量减少，细胞质中出现大量的双层膜结构的自噬小泡；针灸组线粒体的损害明显减轻，溶酶体数量明显增多，能见到与溶酶体体融合的自噬体。提示针灸可以改善MPTP引起溶酶体减少和自噬体积累的情况，使a-Synuclein 蛋白能够有效清除，从而改善帕金森模型的运动障碍。

图4 针灸GB34穴位对帕金森模型小鼠黑质神经细胞超微结构的影响(´5000倍) (a) 正常对照 (b) 模型组 (c) 针灸组Fig.4 Effect of acupuncture treatment on dopaminergic neurons cell structure in the substantia nigra detected by TEM.(a) Control (b) MPTP (c) Acupuncture(AP)

3 讨论

针灸作为一种通过对身体体表面穴位进行刺激或热疗的物理疗法，达到治病防病的目的，受到广大患者的欢迎。尤其在像中风偏瘫、帕金森等运动障碍性疾病的治疗和康复方面，起着举足轻重的作用。但是对其作用机制方面的研究却非常少，许多治疗效果得不到客观合理的解释，就使得针灸具有了神秘的传奇色彩。借助先进的检测手段和现代的医学理论将有助于我们探求针灸的作用机制及经络和穴位的本质。针灸对多种病具有疗效，这种作用实质上有一个共同点，就是通过穴位刺激，使人体气血通畅，重新回复一个平衡状态，即机体层面的稳态。

细胞自噬是近年来提出的一个对维持细胞稳态有重要意义的生理现象，是细胞在应激状态下自保和更新的一种机制。近年来的研究表明，自噬在PD的发病过程占有非常重要的地位。经过MPP处理的神经细胞、MPTP造的小鼠模型和PD病人的中脑黑质中都出现了溶酶体的缺失和自噬体的积累，因为溶酶体膜的通透性改变，蛋白酶外泄，导致自噬体不能与溶酶体融合，不仅大量的有毒蛋白如a-synuclein不能有效清除，而且溶酶体内的蛋白酶外泄后还会损伤正常的细胞及细胞器，导致多巴胺神经元功能受损[10-12]。因此,稳定溶酶体膜及其功能、调节自噬降解通路是治疗PD的又一新的途径。

用MPTP制备的帕金森小鼠模型是目前国内外应用比较广的模型, 可以出现类似帕金森病人的运动不协调和中脑黑质的多巴胺损伤的病理变化。该模型小鼠由于溶酶体功能受到破坏，导致自噬通路中断，进而产生毒性蛋白累积。在本研究中发现，通过针灸治疗能一定程度上改善溶酶体的功能，使累积的自噬体减少，促进a-synuclein 蛋白的降解，从而调节了帕金森模型的自噬。Western blot的结果也支持这一结论，表现为 Lamp1蛋白表达上升，a-synuclein蛋白表达有所下降。这些结果提示，针灸可能通过调节神经细胞自身的自噬水平来清除过度积累的毒性蛋白，从而保护神经细胞免受毒性蛋白的损伤，改善PD小鼠的运动障碍。应该指出，本次实验中使用小鼠的规模较小，还必须进行更大样本的动物实验来得到更加准确，更有说服力的证据。综上所述，本论文在揭示针灸治疗帕金森病的作用及机理方面提供了一条新的思路，其详细的作用机制，尤其是自噬水平上升的确认以及针灸刺激如何转导到中脑黑质发挥作用等，都需要进一步系统深入的研究。

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