续断种子方对少弱精子症模型大鼠生精作用及其超微结构改变的研究①

黄国林，秦耀琮，王权胜，代波，陆海旺，宾彬，唐乾利

（1.广西岑溪市中医院，广西 岑溪 543200 E－mail：htmgx＠163.com；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；3.右江民族医学院，广西 百色 533000）

少弱精子症发病率高，且有逐年增加趋势。通过应用续断种子方治疗少弱精子症的临床研究，我们发现续断种子方在临床中具有较好的疗效。笔者通过建立少弱精子症大鼠模型的实验方法，同时设左卡尼汀口服溶液作阳性对照，观察中药续断种子方对少弱精子症模型大鼠的生精作用。

1 材料

1.1 实验动物分组 实验动物40只雄性大鼠，2月龄，体重200～250g。由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2003－0003。采用随机数字表法随机分为正常组、模型组、续断种子方组、左卡尼汀口服溶液组各10只。

1.2 药品及试剂 续断种子方（主要药物组成：菟丝子15g、杜仲15g、续断15g、骨碎补15g、女贞子15g、枸杞子15g、党参15g、白术15g、淮山药15g），采用单味中药配方颗粒（免煎中药，由江苏省江阴市天江药业有限公司生产）；左卡尼汀口服溶液（由东北制药总厂生产，批准文号：国药准字H19990372）；奥硝唑（由西安博华制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20010514）。

2 方法

2.1 造模及给药 参考文献［1］的造模方法，建立大鼠少弱精子症动物模型，造模方法及给药方法如下：所有大鼠适应性喂养1周后开始灌胃。正常组大鼠每天给予生理盐水灌胃；模型组给予奥硝唑（ORN）［800mg／（kg·d）］；对照组大鼠每天给予ORN［800（mg／kg·d）］加左卡尼汀口服溶液［100mg／（kg·d）］；实验组大鼠每天给予 ORN［800mg／（kg·d）］加续断种子方配方颗粒［10g／（kg·d）］。左卡尼汀口服溶液、续断种子方均溶于生理盐水。以上药物均为每日新鲜配制，当日使用。大鼠灌胃剂量为4ml／d，1次／天，连续4周，给药4周后对各组大鼠进行指标测定。实验自开始之日起，每周称重1次，调整药物用量，并观察记录大鼠的体形、毛色、步态、觅食及活动情况，以及大鼠有无死亡及其可能的原因。

2.2 标本采集 各组大鼠在末次给药24h后，用20%乌拉坦（0.5ml／100g）麻醉后，取各组一半大鼠剪开下腹部，取一侧附睾、睾丸，称其重量并迅速置于盛有2ml预温37℃的生理盐水的平皿中剪碎，于37℃温水浴中温浴2min，大鼠精子充分游离，用MACRO精子计数板检测精子浓度，并计算精子活动率。取大鼠另一侧睾丸组织及附睾组织，保存在戊二醛中固定24h送做超微结构检查。模型组大鼠2只用于造模病理检查后处死，续断种子方组大鼠1只、左卡尼汀口服溶液组大鼠1只灌胃死亡。

2.3 统计学处理 数据处理使用SPSS17.0统计软件，多组计量资料方差齐性时采用单因素方差分析、方差不齐时采用秩和检验。

3 结果

3.1 续断种子方对模型大鼠精子密度及活动率的影响 大鼠附睾游离精子密度与活动率检测结果显示：与正常组相比，模型组精子密度与活动率均明显低于正常组（P＜0.05）；与模型组相比，左卡尼汀口服溶液组、续断种子方组精子密度与活动率明显高于模型组（P＜0.05）；续断种子方组精子密度与活动率都比左卡尼汀口服溶液组高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠附睾游离精子密度及活动率比较 （±s）

表1 各组大鼠附睾游离精子密度及活动率比较 （±s）

注：与正常组比较，a：P＜0.05；与模型组比较，b：P＜0.05；与左卡尼汀组比较，c：P＜0.05

组别 n 精子密度（×106／ml）活动率（%）10 53.05±4.55 70.20±8.54模型组 8 35.34±4.22a40.04±7.05a左卡尼汀口服溶液组 9 47.14±4.87b 63.23±6.34b续断种子方组 9 50.25±5.08bc 66.34±7.58正常组bc

3.2 大鼠附睾组织超微病理学改变 模型组附睾管壁变薄，管腔内精子明显减少，不能充满管腔，排列紊乱，附睾管腔间间隙增大；续断种子方组、左卡尼汀口服溶液组附睾管壁较厚，精子充满管腔，排列较为规则，呈团簇样，管腔间隙较紧密，均与正常组类似，见图1～4。

图1 模型组附睾管腔精子×20000，附睾管腔内精子数量明显减少

图2 左卡尼汀组附睾管腔精子×20000，精子量正常，精子结构基本完整

图3 续断种子方组附睾管腔精子×20000，精子量正常，精子结构基本完整

图4 模型组附睾上皮细胞及纤毛×20000

4 讨论

奥硝唑（ornidazole，ORN）是第三代硝基咪唑类衍生物，具有良好的抗厌氧菌和抗原生质（如滴虫等）感染作用。动物实验主要用于预防各种厌氧菌感染和其对雄性大鼠的生殖功能具有可逆性抑制作用。有学者［2］研究认为ORN对附睾中精子的作用，主要是干扰精子成熟和运动所必需的糖酵解酶，使精子获取能量过程受阻，从而降低了精子的活动率与活力。ORN每日给药量达到一定剂量［800mg／（kg·d）］时，与正常组相比，睾丸重量显著减轻，生精小管内的精子细胞明显减少，管腔内还可见大片脱落的各级生精细胞，甚至有2只大鼠在CASA镜下未发现精子，而呈无精状态。电镜观察到高剂量ORN［800mg／（kg·d）］可导致大鼠生精上皮紊乱，同一层面的细胞发育不同步，精子尾部线粒体鞘部分缺失，线粒体溢出，空泡化，内部结构崩解碎裂。本实验参考庞雪冰等造模方法［1］应用ORN对大鼠灌胃，4周后检测大鼠附睾精子，发现精子活动率及精子密度显著下降，证明少弱精子症大鼠模型造模成功。

本实验结果显示，应用800mg／（kg·d）ORN灌胃，模型组睾丸生精小管管腔内可见脱落的各级生精细胞，附睾管腔中精子数目明显减少，有较多的非精子细胞成分，而续断种子方组、左卡尼汀口服溶液组均可见大量精子，睾丸、附睾未见明显改变。由此得出，续断种子方对大剂量ORN所致的少弱精子症模型大鼠精子数目和活力下降具有良好的保护作用，考虑可能为续断种子方可以修复附睾组织氧化损伤，维持精子发生与成熟的内环境，保护睾丸的正常生精功能。

我们根据多年临床经验，反复实践，形成了自己独特的辨证论治体系，认为男性不育症以肾虚为主，与肝、脾等脏有关，兼夹湿热、肝郁、血瘀等，治疗主张健脾益肾为根本大法，补肾又根据阴阳互根理论，张景岳曰：“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善补阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而泉源不竭”。论治需进行阴中求阳、阳中求阴。因久病、来自家庭的压力，病人或多或少会出现心理问题，中医称之为肝郁，“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”故应疏肝健脾，但一味疏肝会影响精子的活力，应逐渐转向健脾益肾法为主治疗。所以，精子质量低下所致的男性不育症应从调理脾肾入手，临床上也以脾肾亏虚、气血不足为多见。因此，我们确立了“脾肾两虚”为现代男性不育症的基本病理，并以此理论为指导组成中药验方续断种子方治疗男性不育之少弱精子症。临床观察表明续断种子方治疗少弱精子症具有较好效果，能显著提高患者精子活力和活率［2，3］。

此外，刘友章教授提出“中医脾－线粒体相关学说”，在研究中发现，六君子汤对受损伤的线粒体有保护作用，在进行国家“七五”攻关课题“脾虚证候机理研究”中，对脾虚证患者胃黏膜细胞线粒体变化进行电镜观察，报道了脾虚病人胃黏膜壁细胞线粒体数目减少、超微结构受损、能量代谢障碍，提出了“中医脾－线粒体相关学说”，提出中医脾主运化，不仅仅是指食物在胃肠的消化吸收，更重要的是营养物质在线粒体的生物氧化产能过程。线粒体几乎存在于人体全身的组织细胞之中，是细胞对食物进行生物氧化产能的细胞器，有“ATP的生产基地”、“细胞的动力站”之称。这与中医“脾为气血生化之源”、“后天之本”有着密切的联系［4，5］。此外，有报道弱精子症患者精子线粒体基因出现不同程度的异常［6］。结合本研究的实验结果，我们推论，续断种子方可能通过调控体内抗氧化酶活性，提高生精细胞的氧化应激损伤修复能力，维持精子发生发育过程中内环境的稳定，提高生精细胞线粒体ATP的合成，维持睾丸附睾的超微结构等而发挥多途径、多靶点、多环节、多层次的综合调控作用，从而提高机体本身的生育能力。

［1］ 庞雪冰，朱洋，李红钢，等.奥硝唑对大鼠精子的影响及作用机制探讨［J］.中华男科学杂志，2005，11（1）：26－28.

［2］ 王权胜，潘恩山.郑泽棠教授辨证论治男性不育症［J］.辽宁中医药大学学报，2009，12（11）：82－84.

［3］ 王权胜，宾彬，唐乾利，等.从“脾肾两虚”论治少弱精子症58例［J］.辽宁中医杂志，2012，39（5）：889－890.

［4］ 刘友章，王昌俊，周俊亮，等.四君子汤修复脾虚大鼠线粒体细胞色素氧化酶的作用及机制［J］.中国临床康复，2006，10（35）：118－122.

［5］ 刘友章，宋雅芳，劳绍贤，等.胃脘痛患者胃黏膜超微结构研究及中医“脾－线粒体相关”理论探讨［J］.中华中医药学刊，2007，25（12）：2439－2442.

［6］ 冯春琼，宋艳斌，邹亚光，等.弱精子症患者精子线粒体MTCYB、MTATP6基因的检测［J］.中华男科学，2008，12（4）：321－323.