甲基阿魏酸对PDGF－BB刺激的肝星状细胞增殖的影响①

容明智，李丽，李勇文，唐春燕，庞文肖，程钰

（桂林医学院，广西 桂林 541004）

蝉翼藤（Securidaca inappendiculata Hassk）为远志科、远志族五味藤属攀援灌木，是广西民族特色中草药，广西民间称五味藤、丢了棒、一摩消等，为传统名药云香精、正骨水的主药之一。其根茎味辛、甘、苦，性微寒。有祛风湿、清热利尿、活血化瘀、消肿止痛的功效，民间常用于治疗急性黄疸性肝炎的湿热黄疸等证［1］，现有的药理学研究表明，蝉翼藤具有较强的抗菌消炎、抗癌、抗病毒、抗HIV、免疫增强等多种活性，具有较好的研究价值［2～5］。据报道蝉翼藤有机酸成分具有抗乙肝病毒的作用，对鸭乙肝病毒所致的鸭肝细胞损伤也有较好的保护作用［2］，为了进一步明确蝉翼藤有机酸中具有保肝作用的活性成分，本课题组对蝉翼藤有机酸成分进一步分离纯化，得到化合物Ⅰ～Ⅲ三种白色结晶，利用小鼠急性肝损伤实验对三种化合物进行活性筛选实验，证明Ⅰ结晶保肝作用最强。经鉴定Ⅰ结晶为甲基阿魏酸（meth－ferulic acid，MFA）。

本课题通过采用肝星状细胞（HSC－T6），应用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测MFA对PDGF－BB刺激的HSC细胞增殖的影响，为进一步研究MFA抗纤维化作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 肝星状细胞系HSC－T6，为SV40转染SD大鼠，其表型为活化的HSC。由广西医科大学药理学教研室培养传代。

1.2 药物与试剂 MFA是从广西特色中草药蝉翼藤茎皮中提取、分离、纯化得到一种单体，纯度98%以上，由本课题组自行制备。PDGF－BB：上海高创化学科技有限公司（CYT－501）；胰酶蛋白：北京博艾尔科技有限公司（20111208）；DMEM培养基：上海泛柯生物北京分公司（20111206）；小牛血清：上海酶联生物科技有限公司（20110302）；二甲亚砜：上海劲马实验设备有限公司（20110112）；青霉素：哈药集团制药总厂（20110324）；链霉素：哈药集团制药总厂（20110405）。

1.3 仪器 自动酶标仪Model450：美国Bio－Rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 空白对照组：不加任何药物处理；模型组：PDGF－BB 10ng／ml；不同浓度 MFA处理组，即 MFA2.5μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml组；MFA 5μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml组；MFA 10μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml组；MFA20μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml组；MFA 40μg／ml＋PDGF－BB 10ng／ml组。

1.4.2 实验步骤［2］①取对数生长期 HSC细胞接种于细胞瓶，用浓度为0.25%的胰蛋白酶液消化，使细胞脱壁，然后置于离心机离心并用台盼蓝染色及计数，用DMEM培养液（含10%小牛血清）配制成浓度1×105／ml的细胞悬液，加入96孔培养板，按100μ1／孔的量加入，每组均设置5个复孔，放置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。试验重做5次。②首先进行药物同步化处理细胞后，接着用PDGF－BB刺激30min，然后再分别加入不同浓度的MFA共同孵育；空白对照组不加任何药物进行处理；模型对照组仅用PDGF－BB刺激；分别将96孔板放置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24、48、72h。③终止培养前4h每孔加入20μl的MTT液，继续孵育4h后，再吸去上清液，细胞用无血清培养基洗涤一次，然后加入二甲亚砜（DMSO）使细胞裂解，每孔150μl，置于酶标仪中，振荡溶解10min，在490nm波长处测定A值。④计算各处理组细胞的平均生长抑制率的公式如下：细胞生长抑制率＝［（模型组对照组－正常对照组）－（药物处理组－正常对照组）］／（模型组对照组－正常对照组）×100%。

2 结果

MFA对PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖作用的影响：对加入外源性刺激因子PDGF－BB（10ng／ml）刺激的模型组与不加外源性刺激因子的正常对照组加以比较，结果发现HSC－T6在24h处有一定变化，而在48、72h处增殖较为明显，其中以48h增殖最为显著；对不同浓度MFA作用组与PDGFBB刺激组进行比较，发现不同浓度MFA作用组均能抑制PDGF－BB刺激的HSC增殖，并且随MFA浓度增加抑制作用增强。结果见表1、表2。

表1 MFA对PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的影响 （±s，每组n＝5）

表1 MFA对PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的影响 （±s，每组n＝5）

注：与空白对照组比较，a：P ＜0.05，b：P ＜0.01；与模型对照组比较，c：P＜0.05，d：P＜0.01

组别 剂量（μg／ml）吸光值（OD值）24h 48h 72h空白组 － 0.316±0.025 0.538±0.028 0.603±0.020模型组 － 0.337±0.033a0.745±0.031b 0.795±0.017ac MFA 组 2.5 0.323±0.031 0.732±0.022ac 0.754±0.033bc 5 0.338±0.021ac 0.687±0.046bc 0.734±0.053bc 10 0.343±0.033bc 0.629±0.040bc 0.684±0.039bd20 0.367±0.024bd 0.588±0.033bd 0.654±0.047bd 40 0.361±0.014bd 0.561±0.024bd 0.632±0.037bd

表2 MFA对PDGF－BB刺激的HSC－T6增殖的抑制率 （n＝5）

3 讨论

在各种病因引起的慢性肝脏疾病中，每一种损伤性因素所引起的肝脏病变都可能引起肝细胞坏死、炎症，并且进一步继发纤维化的病理生理特征。肝纤维化是发展到肝硬化的一个必经阶段，HSC活化增殖并合成分泌大量的细胞外基质是肝纤维化发生进展进程的中心环节，因此抑制HSC的活化增殖就成为防治肝纤维化的有效策略之一，也是肝纤维化防治研究的热点［6，7］。

肝纤维化中的PDGF主要来自血液中的血小板、肝库普弗细胞、星状细胞、肝窦内皮细胞、单核细胞等。PDGF包括－AB、－AA、－BB三种形式，其中PDGF－BB主要位于肝脏部位，促进HSC增殖的作用也最强。PDGF－BB是目前发现的最强的促进HSC增殖的因子之一，对HSC的活化和增殖具有明显的促进作用，在抗肝纤维化研究中十分受到重视。肝纤维化发生发展的进程中，PDGF分泌增加而且能通过其膜受体激活肝星状细胞内的ERK1／2、PI3－K、JAK／STAT等信号转导通路，其中PDGF激活的最主要的途径是ERK1／2通路，从而进一步促进HSC活化增殖，以及胶原和α－SMA的合成而促进纤维化进展。因此，PDGF是肝纤维化过程中重要的损伤因素，阻断PDGF对HSC生物学行为的作用，将成为抗肝纤维化药物研究的一条重要途径［8］。MFA是本研究组从广西特色植物蝉翼藤中提取分离纯化而得到的单体化合物，本课题组前期动物实验表明MFA对肝纤维化有明显的防治作用。但是，MFA对PDGF－BB刺激的HSC增殖活性是否有影响尚未见报道。

因此，课题本部分以从广西特色中草药蝉翼藤中提取分离得到的MFA作为干预药物，观察其对PDGF－BB刺激的HSC增殖活性的影响。实验结果表明2.5、5、10、20、40μg／ml浓度的MFA，对PDGF－BB刺激的HSC增殖活性具有明显抑制效应，提示MFA能有效抑制PDGF－BB对HSC的增殖及其生物行为特性的作用，以时间48h、浓度40μg／ml为最佳。但是MFA抑制作用的分子机制尚不清楚，是否与PDGF－BB通过其膜受体激活信号通路活性有关，尚待进一步深入研究，本课题组将在以后的实验中做进一步的探索。

［1］ 中国科学院昆明植物所.云南植物志［M］.北京：科学出版社，1983：261.

［2］ 李勇文，李丽，张士军.含蝉翼藤大鼠血清的免疫调节作用［J］.中国现代应用药学杂志，2007，24（6）：452－456.

［3］ 李勇文，李丽，李梅，等.蝉翼藤对小鼠脾细胞体外增殖和淋巴因子分泌水平的影响［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（5）：43.

［4］ 李勇文，李丽，李植飞.五味藤抗炎作用及其机制初探［J］.中国中医急症，2006，15（8）：898－900.

［5］ 李丽，李勇文，唐爱存.蝉翼藤氯仿提取物的抗炎和免疫增强作用［J］.中药药理与临床，2011，27（4）：62－64.

［6］ 张士军，张志伟，陈兆霓，等.复方六月青对肝星状细胞增殖和细胞外基质的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：135－137.

［7］ 陈莲香，舒建昌.PDG与肝纤维化关系的研究新进展［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2011，20（1）：95－98.

［8］ 曹荣娟，李俊，詹迪迪，等.玉屏风多糖对肝星状细胞中PDGF－BB、PDGFR－β的表达及ERK1／2通路的影响［J］.安徽医科大学学报，2011，46（9）：861－864.