KGF－1二硫键突变体对肝纤维化的保护作用

谢 敏，万 颖，张增涛，何建军，杨 黎，范 开

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.重庆富进生物医药有限公司，重庆 400041)

天然野生型 hKGF－1(keratinocyte growth factor－1，KGF－1)［1］由163 个氨基酸组成，含5 个 Cys，形成 Cys1－Cys15、Cys102－Cys106两对二硫键，Cys40以游离形式存在于分子内部。全长hKGF－1蛋白质不稳定，容易发生聚集［2－4］。已有文献报道［5］:将全长hKGF－1的N 端缺失23个氨基酸，只形成 Cys102－Cys106一对二硫键时(以下简称△23KGF－1)，不仅没有影响其生物活性，还提高了稳定性;另外，在△23KGF－1的基础上针对其剩余的3个半胱氨酸依次进行定点突变发现，只有突变102位半胱氨酸对于其稳定性没有影响［6］。本研究在此基础上将△23KGF－1第102位的Cys突变为 Ser［7］，这种新型的 hKGF－1 突变体(以下简称为△23Ser102KGF－1)［8］具有抗组织纤维化的功能，但是该研究并未证明其抗纤维化的功能与样品是否与40位和106位的二硫键具有相关性。本研究以大鼠试验性肝纤维化和肝星状细胞为模型，进一步明确△23Ser102KGF－1突变体中的抗肝纤维化的功能与样品中Cys102－Cys106这对二硫键的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品

△23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1冻干粉，重庆富进生物医药有限公司提供，纯度99.0%，批号 20100603;羟脯氨酸试剂盒(碱)，南京建成生物工程研究所制造，批号110213;CCl4，重庆化学试剂厂生产，批号100405;人肝星状细胞系，武汉细胞所提供;DMEM高糖培养基(1×)，赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司生产，批号 NWF6420;胎牛血清，Invitrogen公司生产，批号619559;乙腈，默克公司生产，色谱纯;三氟乙酸，美国TEDIA生产。

1.2 主要仪器与实验动物

清洁级雄性SD大鼠36只，体质量220～250 g，由解放军第三军医大学实验动物中心提供;7600全自动生化分析系统，日本日立公司制造;SpectraMax190型酶标仪，美国 Molecular Devices公司制造;CO2细胞培养箱(型号HF151UV)，日本三洋公司制造;安捷伦1100高效液相色谱系统;DAD检测器;二元输液泵;ultimate XB－C18色谱柱，规格:4.6 ×250 mm，5 μm，300Å。

1.3 方法

1.3.1 结构确认

将△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1冻干粉通过还原和非还原肽图分析其二硫键的形成情况。样品处理及色谱条件参照《中华人民共和国药典》2010年版第3部附录ⅧE“肽图检查法”。

1.3.2 人肝星状细胞系体外活性测定

将人肝星状细胞系(hepatic stellate cell，HSC)快速解冻并培养于含有10%FBS和0.5%双抗的DMEM高糖培养基，37℃，5%CO2培养6 h，待细胞贴壁后更换新的含有10%FBS和0.5%双抗的DMEM高糖培养基培养过夜。用0.5%胰蛋白酶消化细胞传代2次后用台盼蓝染色计数，并转移至96孔细胞培养板，每孔约5000个细胞，培养8 h。待细胞贴壁后，将培养板中的培养基换成含有1.0%FBS和0.5%双抗的DMEM高糖培养基进行饥饿过夜培养。样品的稀释:① TGF－1阳性对照药用含有1.0%FBS和0.5%双抗的DMEM高糖培养基稀释成 200、40、8、1.6、0.32IU 五个梯度，并设2个复孔。② △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102KGF－1 C40－C106三种样品均稀释成0.32 ng、1.6 ng、8 ng、40 ng、200 ng、1 μg 六个梯度，并设2个复孔。饥饿培养结束后将上层培养基移除，并将上述稀释好的阳性对照药、3种样品以及阴性对照组加入细胞培养板，每孔200 μL，于37℃，5%CO2条件下培养48 h。培养结束后用MTS于37℃染色1 h，490 nm处测定OD值。

1.3.3 肝纤维化模型的建立和治疗

SD大鼠于清洁条件下适应性饲养1周，随机分成5组:空白对照组、模型组、△23KGF－1组、△23Ser102KGF－1 组 和 △23Ser102C40－C106KGF－1组，每组6只。

模型的建立:模型组和给药组用20%CCl4灌胃(CCl4与玉米油1∶4混合)，剂量2 mL/kg，每周2次，连续8周。

给药:造模的同时，正常对照组和模型组腹部皮下注射适量生理盐水，每天1次，连续8周。△23KGF－1、△23Ser102C40－C106KGF－1 和△23Ser102KGF－1造模同时腹部皮下注射药物，剂量为3 mg/kg，每天1次，连续8周。所有大鼠在第56 d处死，股动脉收集血液进行血液生化指标的测定，并取新鲜的肝组织相对固定的位置进行甲醛固定、制片和羟脯氨酸的测定。

1.3.4 检测指标

取大鼠的血清进行谷丙转氨酶和谷草转氨酶的测定。取新鲜的肝组织进行羟脯氨酸的测定。取大鼠肝脏用福尔马林进行固定，Masson染色，制备成病理切片。

1.3.5 统计学处理

将大鼠的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和羟脯氨酸含量用SPSS16.0统计分析软件进行t分布计算和标准差分析，结果用¯x±s表示，P＜0.05表达差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结构分析

由图1可见在非还原肽图中保留时间为21 min的峰经还原肽图处理后变成19 min和24 min的2 个峰，证明△23Ser102C40－C106KGF－1 组的样品含有1对二硫键，且形成完全，因为样品只含有40位和106位2个半胱氨酸，因此可以确定△23Ser102C40－C106KGF－1 组含有 C40－C106这一对二硫键。由图2可见△23Ser102KGF－1组的还原肽图和非还原肽图可以完全重合，因此可以说明△23Ser102KGF－1组不含二硫键。

2.2 3种KGF－1突变体对hHSC体外测活结果

由图3结果可见:与△23KGF－1和△23Ser102C40－C106KGF－1 两组相比，△23Ser102KGF－1 组对人HSC细胞系有明显的抑制作用，并且与剂量呈正相关性;△23KGF－1 和 △23Ser102C40－C106KGF－1 两组抑制作用不明显。由图4可见，与空白组相比，TGF－1有明显的刺激作用，这与文献报道的一致［9］。

图4 TGF和空白2个样品对人肝星状细胞系的作用

2.3 血液生化指标和羟脯氨酸检测结果

由表1结果可见:与模型组比较，△23Ser102KGF－1组大鼠血清 AL T、AS T水平均明显降低(P＜0.05)，同时对肝组织中Hyp量的升高也有一定抑制作用(P＜0.05);但未见△23KGF－1组和△23Ser102C40－C106KGF－1 组对 AL T、AS T 和 Hyp有明显影响。

表 1 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1 三个样品的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和羟脯氨酸结果

2.4 大鼠肝脏病理组织学检验结果

由病理切片(图5)可见:连续造模4周后，模型组肝组织正常结构破坏严重，肝细胞索排列紊乱并且水肿，汇管区和中央静脉区可见肝细胞大面积死亡，炎细胞浸润严重，大量脂肪细胞变性，胶原纤维明显并形成了假小叶，大部分动物肝纤维化程度达到5级;△23Ser102KGF－1组与正常组相比可见部分肝脂肪细胞变性，以水样变形为主，少量炎细胞浸润局部细小纤维增生但未形成间隔，细胞索排列较整齐，肝纤维化程度多为1～2级;△23Ser102C40－C106KGF－1 组大量脂肪细胞变性，肝细胞索排列紊乱并且呈水样变性，少量炎细胞浸润局部细小纤维增生但未形成间隔，大部分动物肝纤维化程度达到2～3级;△23KGF－1组肝组织正常结构破坏严重，肝细胞索排列紊乱并且水肿，气球样变，汇管区和中央静脉区可见肝细胞大面积死亡，炎细胞浸润严重，大量脂肪细胞变性，胶原纤维明显并形成了假小叶，大部分动物肝纤维化程度达到5级或以上。

图 5 △23KGF－1、△23Ser102KGF－1 和△23Ser102C40－C106KGF－1组的大鼠肝脏病例切片(Masson染色40倍)

3 讨论

肝纤维化的过程实际上是一个肝脏细胞受损的应激过程。当肝细胞受到机械损伤或者病毒感染等不良刺激之后，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)被激活，并大量合成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)［10］，从而加速了肝纤维化的进程。实际上，肝纤维化的过程是一系列细胞因子与其受体相互作用的结果，例如TGFβ－1及其受体TRⅠ、IL－1及其受体等，这些细胞因子与其受体结合并作用，从而刺激肝星状细胞等的分裂，导致病情的加重，由此可见细胞因子是肝纤维化最重要的一环，因此如何抑制细胞因子的分泌和阻断受体的结合就成为了肝纤维化治疗的靶点。本研究组在体外细胞实验中将3种突变的细胞因子直接作用于人肝星状细胞系，发现:KGF－1突变体蛋白不含Cys40－Cys102二硫键组，可明显抑制人肝星状细胞系的生长，因此可以推断KGF－1突变体的抗纤维化作用可能跟抑制肝星状细胞的生长并间接影响其生长因子的分泌有关。

文献［11］报道蛋白质二硫键的形成与否可以改变蛋白质的三级或者四级结构，从而影响其空间构象和功能。本实验用大鼠实验性肝损伤和人肝星状细胞系进一步证明了蛋白质的二硫键会影响其生物学功能。本实验不仅对于抗纤维化的机理和研发新型抗纤维化药物具有比较重大的意义，而且本实验探讨的蛋白质的功能与二硫键的关系还可以为以后深入研究蛋白质的构效关系提供参考。

［1］Rubin J S，Osada H，Finch P W，et al.Purification and characterization of a newly indentified growth factor specific for epithelial cells［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1989(86):802－806.

［2］Yueh－Rong Hsu，Eric W J.Human Keratinocyte Growth Factor Recombinantly Expressed in Chinese Hamster O－vary Cells:Isolation of Isoforms and Characterizationof Post－Translational Modifications［J］.Protein expression and purification，1998(12):189－200.

［3］Alarid E T，Rubin J S，Young P，et al.Keratinocyte growth factor functionsin epithelial induction during seminal vesicle development［J］.ProcNatlAcadSciUSA，1994，91(3):1074－1078.

［4］Staiano－Coico L，Krueger J G，Rubin J S，et al.Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing［J］.J Wed，1993(178):865－878.

［5］Lance A B，Marlene B，Shefali G.Denise Idler，and Per－Erik Mansson Ohmeda，PPD，100 Mountain Acenue，Murray Hill，NJ 07974 Effect of cysteine substitutions on the mitogenic activity and stability of recombinant human ketatinocyte growth factor［Z］.1999:872－879.

［6］Eric H，Timothy O.Enhanced Stability of recombinant keratinocyte growth factor by mutagenesis Protein Engineering［J］.Design ＆Selection，2006，19(4):147－153.

［7］张增涛，陈清.重组人角质细胞生长因子Ⅰ型缺失突变体二硫键配对与生物活性［J］.重庆理工大学学报:自然科学版，2010(4):23－26.

［8］霍黉琦，李新平，范开.重组人角质细胞生长因子的体内外作用研究［J］.中国药学杂志，2005，40(22):1749－1752.

［9］姜虹，李定国.TGF－β1与肝纤维化［J］.世界华人消化杂志，2003，3(11):326－329.

［10］唐东，吴建新.肝组织特异性基因启动子靶向干预肝纤维化的研究现状［J］.国际消化病杂志，2011，31:97－100，111.

［11］杨锡昌.蛋白质四级结构中的二硫键［J］.安徽医科大学学报，1986(4):108－201.