Semi－LC／MS技术快速定量分析黄芪样品中黄芪甲苷含量

郑 重，宋凤瑞，刘 舒，赵先恩，刘志强，刘淑莹

（1.中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心，吉林 长春 130022；2.中国科学院研究生院，北京 100049）

Semi－LC／MS技术快速定量分析黄芪样品中黄芪甲苷含量

郑 重1，2，宋凤瑞1，刘 舒1，2，赵先恩1，刘志强1，刘淑莹1

（1.中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心，吉林 长春 130022；2.中国科学院研究生院，北京 100049）

为了测定黄芪中的黄芪甲苷含量，应用半高效液相色谱－质谱串联技术（Semi－LC／MS），以薯蓣皂苷为内标化合物，仅用一段色谱保护柱分离掉大部分干扰性成分，同时使目标化合物富集，采用Waters公司的多反应监测（MRM）扫描模式检测。结果表明：黄芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范围内线性关系良好，稳定性和重复性实验RSD＜3%，样品回收率达98.9%。Semi－LC／MS方法可以对黄芪样品中黄芪甲苷进行快速定量分析，是一种黄芪甲苷的简单、高效、灵敏的定量检测方法。

黄芪甲苷；半高效液相色谱－质谱串联技术（Semi－LC／MS）；多反应监测（MRM）；定量分析

黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao、膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）的根，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效［1］，含皂甙、多糖、多种氨基酸及硒、锌、铜等多种微量元素。黄芪甲苷为黄芪的主要有效成分，是其质量控制的主要指标。黄芪甲苷的分析方法已有比色法、荧光分光光度法、薄层扫描法、HPLC 法（含 UPLC 法）、HPLC－MS法等［2－9］。其中比色 法、薄层扫描法存在定量不准确的缺点；荧光分光光度法实验条件苛刻，对实验者操作技能要求较高；由于黄芪甲苷吸收波长在200nm左右，给常规HPLC分析带来挑战；目前高效液相色谱－蒸发光散射（HPLC－ELSD）法是较为常用的黄芪甲苷的测定方法，但其检测灵敏度受到蒸发光检测器的制约，不适合微量样品分析。本工作采用半高效液相色谱－质谱串联技术（Semi－LC／MS）测定黄芪中的黄芪甲苷含量，优化检测条件，旨在建立一种简便、快速、准确的黄芪甲苷的定量检测方法。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

Acquity Ultra Performance LC系统：美国Waters公司产品；XEVO－TQ三重四极杆质谱：美国Waters公司产品，配有 Waters Masslynx V4.1数据工作站。

1.2 主要材料与试剂

黄芪甲苷对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号：110781200613，供含量测定用；薯蓣皂苷标准品；黄芪药材：购自北京同仁堂药店、吉林大药房、益和大药房；乙腈：美国Fisher公司产品，色谱纯；甲醇、正丁醇、氨水：分析纯，均为北京化工厂产品；实验用水为超纯水。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C18柱（2.5μm，4.6×20mm）；流动相：V（乙腈）∶V（水）＝55∶45的混合溶液；流速：0.7mL／min；柱温：室温；进样体积：3μL。

1.3.2 质谱条件 以薯蓣皂苷为内标化合物，负离子模式检测，采用多反应监测（MRM）方式定量，毛细管电压2.50kV，离子源温度350℃，脱溶剂气体流速800L／h，锥孔气流速50L／h，碰撞气流速0.15mL／min，得到的质谱图示于图1。

1.4 对照品储备液的制备

图1 质谱总离子流图（a）、黄芪甲苷MRM离子流图（b）和薯蓣皂苷MRM离子流图（c）Fig.1 Total ion current chromatogram（a），MRM spectrum of Astragaloside（b）and MRM spectrum of Dioscin（c）

准确称取黄芪甲苷对照品5.70mg，以甲醇溶解，并定容到10mL容量瓶中，摇匀，即得0.570g／L的黄芪甲苷对照品溶液。准确称取薯蓣皂苷标准品10.01mg，以甲醇溶解，并定容于10mL容量瓶中，摇匀，即得1.00g／L薯蓣皂苷对照品溶液。

1.5 样品溶液的制备

取黄芪药材粉末4.089 2g，置索氏提取器中，加甲醇40mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4h，提取液回收溶剂并浓缩至干，加水10mL，微热使残渣溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，加水5mL使残渣溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂（内径1.5cm，长12cm），以50mL水洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继续用70%乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解，并转移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得待测样品。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

分别采用电喷雾正离子模式与负离子模式对黄芪甲苷与薯蓣皂苷进行分析，发现在负离子模式下两者均有很好的质谱信号响应，所以最终确定采用负离子模式对这两种化合物进行分析，并对其MRM条件进行了优化，其结果列于表1。选择其中信号最强的离子对进行定量测定。

表1 黄芪甲苷与薯蓣皂苷的MRM质谱条件Table 1 The MRM conditions ofAstragalosideandDioscin

2.2 线性关系考察

分别准确吸取浓度为2.85、5.70、11.4、14.25、28.5、42.75、57.0mg／L的黄芪甲苷对照品溶液（含0.50mg／L的薯蓣皂苷对照品内标），按1.3色谱、质谱条件测定，以对照品溶液质量浓度为横坐标（x），黄芪甲苷峰面积与薯蓣皂苷峰面积比值为纵坐标（y）绘制校准曲线，计算回归方程为y＝0.011 5x＋0.013 6，r2＝0.991 3，样本含量n＝7，F＝661，黄芪甲苷在2.85～57.0mg／L的范围内线性关系良好，其线性曲线示于图2。

图2 黄芪甲苷线性曲线Fig.2 The standard curve of Astragaloside

2.3 稳定性试验

取所制备的黄芪样品溶液，稀释5倍后，取200μL，加入50μL薯蓣皂苷标准品，定容于1mL容量瓶中，分别在0、2、4、8、12、24h测定黄芪甲苷的峰面积与薯蓣皂苷峰面积，计算峰面积比值的RSD为2.12%。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

2.4 重复性试验

取同一样品按1.5项方法制备6份样品溶液，稀释5倍后，取200μL，加入50μL薯蓣皂苷标准品，定容于1mL容量瓶中，分别进样，测定黄芪甲苷峰面积与薯蓣皂苷峰面积，计算黄芪甲苷含量，RSD为2.41%。

2.5 回收率试验

准确称取已知含量（0.638mg／g）的黄芪药材，共6份，分别准确加入黄芪甲苷对照品溶液（含黄芪甲苷1.425mg），按1.5项方法制备供试液，稀释5倍后，取200μL，加入50μL薯蓣皂苷标准品，定容于1mL容量瓶中，测定并计算平均回收率为98.9%，RSD为1.77%。

2.6 样品含量测定

采用1.5项方法，对不同批次的黄芪药材进行处理，用1.3项色谱、质谱方法进行测定，各样品中的黄芪甲苷的含量测定结果列于表2。

表2 黄芪中黄芪甲苷的含量测定结果（mg／g）Table 2 Content ofAstragalosideinAstragalusSamples（mg／g）

2.7 结果讨论

由于质谱检测器的高灵敏度，使得LC／MS技术在药物定性定量分析领域有广泛的用途［10－14］。但是由于常规 HPLC消耗时间长，质谱检测器的信号稳定性不如紫外等常规检测器，中药复杂体系干扰因素较多，来自于溶剂中的噪音对信号产生干扰，这些都制约着LC／MS技术应用于药物定量领域的发展。本试验采用多反应监测（MRM）扫描模式［15－21］，以母离子－子离子反应通道作为定量手段，能够有效的排除存在于提取物中非目标化合物的干扰，因皂苷类成分在负离子模式下信噪比较高，而且碎裂能量低，故本试验采用负离子模式检测。试验中曾经尝试从自动进样器进样，不经过任何色谱柱，直接对待测样品进行MRM分析，但由于提取物含有复杂的干扰性成分，在离子化过程中存在电离竞争反应，导致目标化合物离子化效率不高且重现性差；并且从进样开始样品在流路中一直处于扩散状态，导致色谱峰型展宽，影响定量重现性；因此从信噪比、峰型、定量效果等方面都不能得到满意的结果，于是采取了连接一段保护柱（Waters XBridge C18柱，2.5μm，4.6×20mm）的方案，能够分离掉大部分干扰性成分，同时能够使目标化合物达到富集效果。试验中引入薯蓣皂苷作为内标化合物，进一步提升了定量稳定性，得到了令人满意的效果。虽然采用了Waters XBridge C182.5μm，4.6×20mm色谱柱，但是其作用仅仅为目标物富集与干扰物分离，并不需要高性能色谱柱来实现分离，同时与常规LC不同，目标物与内标化合物出峰时间均在1min之内，检测时间可与UPLC相媲美。

3 结 论

采用Semi－LC／MS技术，多反应监测模式，建立了黄芪药材中黄芪甲苷的快速、准确、高灵敏的分析方法。Semi－LC法与常规HPLC法相比，能够显著提高分析效率、节省分析时间、减少溶剂损耗，并且质谱（MRM模式）优秀的选择性，能避免实际分析中的假阳性结果。

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Rapid Quantitative Analysis of Astragalosidein the Astragalus Samples by Semi－LC／MS

ZHENG Zhong1，2，SONG Feng－rui1，LIU Shu1，2，ZHAO Xian－en1，LIU Zhi－qiang1，LIU Shu－ying1
（1.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Science，Changchun130022，China；2.Graduate School of Chinese Academy of Science，Beijing100049，China）

In order to determinate the astragaloside in the astragalus by Semi－LC／MS，diosgenin is used as an internal standard compound，a chromatography guard column was used to remove most interference components and enrich the target compound which was subsequently determined by MS under multiple reaction monitoring（MRM）scanning－mode.The calibration curve is linear over the range of 2.85—57.0mg／L of astragaloside.The RSDs for the stability and reproducibility experiments are less than 3%，and sample recovery rate is 98.9%.Semi－LC／MS is one simple，efficient，sensitive method for rapid quantitative analysis of astragaloside in astragalus samples.

Astragaloside；semi－high performance liquid chromatography－mass spectrometry（Semi－LC／MS）；multiple reaction monitoring（MRM）；quantitative analysis

O657.63

A

1004－2997（2012）04－0208－04

2012－03－31

2012－06－13

国家自然科学基金 （20953001）、吉林省与中国科学院科技合作资金（2010SYHZ0052，2011CJT0015）项目资助

郑 重（1978～），男（汉），吉林省长春人，助理研究员，从事天然药物化学与有机质谱学研究。E－mail：zhengzh＠ciac.jl.cn

刘志强（1962～），男（汉），研究员，从事天然药物化学与有机质谱学研究。E－mail：liuzq＠ciac.jl.cn