1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在线联用分析

张 萍，王仲孚，黄琳娟

（1.咸阳师范学院化学与化工学院，陕西 咸阳 712000；2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069）

1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮衍生化寡糖的HPLC－ESI／MS在线联用分析

张 萍1，2，王仲孚2，黄琳娟2

（1.咸阳师范学院化学与化工学院，陕西 咸阳 712000；2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069）

为了给寡糖质量控制和分析研究提供方法参考，对1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）衍生化试剂在液相色谱（HPLC）和电喷雾质谱（ESI－MS）技术分析寡糖中的应用进行研究。用PPMP试剂在氨水介质中对葡寡糖链进行衍生化，衍生化产物用RP－HPLC分离，ESI－MS分析。实验表明：在确定的衍生化条件下，PPMP和寡糖的衍生化主产物为单分子标记物，葡寡糖混合物的单分子PPMP衍生物在ESI－MS的正负离子模式下均有较好的响应，并且在RP－HPLC柱上能够实现很好地分离。据此建立了PPMP柱前衍生，HPLC－ESI／MS在线联用分析寡糖混合物组成的方法。该方法定性准确、样品处理简单、分析速度快、结果准确可靠，可作为寡糖样品的质量控制、构效关系研究等方面的一种测试方法。

高效液相色谱；电喷雾电离质谱；1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮；衍生化；寡糖

寡糖（oligosaccharide）又称寡聚糖或低聚糖，一般是由2至10个单糖缩合而成的聚合物［1－3］。近年来随着分子生物学、医学、生物化学等前沿交叉学科的发展，人们对寡糖构效关系的认识逐渐提高，寡糖成为近年来研究的热点。研究表明许多寡糖具有低热、稳定、安全无毒、无残留等理化性质，能够抑制细菌、提高机体免疫能力、降低血清胆固醇、抗病毒和抑制肿瘤细胞［1－7］，在疾病诊断与预防、营养与保健、畜牧养殖、植物生长调节及抗病毒等方面有巨大的应用潜力［8］。由于糖类化合物本身水溶性强、极性较高、成分复杂、无明显的光学吸收，使其分析检测存在很大的困难。到目前为止，用于寡糖分析的方法有薄层色谱法（TLC）、毛细管电泳法（CE）、糖电泳法、高效液相色谱法（HPLC）以及质谱法［9－14］。其 中 HPLC、生 物 质 谱 （MS）以 及HPLC－MS联用技术是目前分析寡糖强有力的工具［13－16］。对寡糖进行衍生化可以改善寡糖的疏水性、光学吸收和质谱检测的离子化效率，增强 HPLC和 MS分析的灵敏度［17－19］。

1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PPMP）是本研究组合成的一种1，3－取代吡唑啉酮类试剂，是传统糖类衍生试剂PMP（1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮）的类似物。本实验在实现PPMP柱前衍生－HPLC－ESI／MS分析单糖混合物［20］的基础上，以葡寡糖为实验对象，将PPMP衍生化扩展到对寡糖的柱前衍生 HPLC－ESI／MS分析的研究上，以期为寡糖的分析提供方法参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Thermo LTQ XL型高效液相色谱－质谱联用仪：美国Thermo公司产品，配有Finnigan Surveyor PDA检测器、自动进样器以及四元梯度泵、电喷雾电离源（ESI）、离子阱质量分析器。

1.2 主要材料与试剂

1－（4－异丙基）苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮：自制，HPLC测定纯度大于99.2%；葡寡糖混合物，又名麦芽糊精（maltodextrin）：美国Sigma公司产品；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司产品；二氯甲烷、氨水、乙酸铵等：均为分析纯，天津第三化学试剂厂产品。

1.3 实验条件

1.3.1 HPLC 条件 采用 Symmetry Shield RP18（4.5m×250mm，5μm）色谱柱；流动相：0.01mol／L NH4Ac溶液（pH 4.5）和乙腈的混合溶液；梯度洗脱；柱温37℃；流速800μL／min；UV检测波长为245nm；进样量10μL。

1.3.2 质谱（ESI－MS）条件 鞘气流速12L／min；辅助气1.5L／min；毛细管温度375℃；正离子模式下，喷雾电压5kV，毛细管电压48V，透镜电压80V；负离子模式下，喷雾电压5kV，毛细管电压－48V，透镜电压－120V；HPLC、ESI－MS联用时，流动相在流经UV检测器后采用分流比1∶4进入MS分析。

1.4 标记衍生化

准确称取1.0mg的葡寡糖maltodextrin于5mL反应瓶中，用100μL Mill－Q水充分溶解，加入100μL 0.1mol／L的PPMP甲醇溶液和50μL的氨水，涡旋混匀后，在80℃水浴反应70 min，N2吹干，加1.0mL Mill－Q 水和1.0mL CH2Cl2充分溶解并震荡、离心，弃去下层CH2Cl2相，同法用CH2Cl2萃取水相3次，以去除过量的PPMP试剂，水相即为PPMP衍生化的maltodextrin混合物试液。以13 000r／min高速离心后，取两等份，分别用于ESI－MS及HPLC联用分析。

2 结果与讨论

2.1 衍生化产物的结构

由于1，3取代的吡唑啉酮试剂的吡唑酮环上C4位存在α氢，在碱性环境下离去成为烯醇式负离子，和糖类物质的还原端进行醛酮之间的缩合反应，在加热条件下失水成为具有α，β不饱和酮结构的单分子衍生物。此单分子衍生物会继续与另一分子吡唑啉酮试剂的烯醇式负离子进行Michael 1，4加成反应，从而也可能使糖类物质标记上2分子吡唑啉酮试剂。反应式示于图1。

图1 PPMP与还原性寡糖的衍生化反应原理Fig.1 Derivatization reaction mechanism of oligosaccharides with PPMP

由于Michael 1，4加成是一个受温度控制的可逆反应，产物可能有单分子PPMP和双分子PPMP两种衍生产物，实际中控制合适的反应条件，可使反应向主产物方向进行。由于单分子PPMP衍生物比双分子PPMP衍生物具有较好的稳定性，本研究组已经探索出单糖与PPMP生成单分子衍生物的条件［20］，即还原单糖与PPMP的物质的量之比为1∶6～1∶7，反应温度80℃，反应时间70min。在此条件下，按照1.4衍生化步骤，对葡寡糖进行PPMP衍生化，产物经ESI－MS检测，证实了该条件下衍生化主产物仍为单分子PPMP标记物。

2.2 寡糖混合物的HPLC－ESI／MS分析方法的建立

2.2.1 PPMP标记的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的ESI－MS分析 取少量PPMP衍生化的葡寡糖混合物，用水稀释10倍后，通过蠕动泵进ESI－MS分析，以PPMP标记的聚合度（Dp）为1的葡寡糖衍生物的分子离子峰［Glc＋PPMP＋H］＋m／z379.0为基准，对MS仪正离子检测模式下的参数进行自动调谐和优化，得出ESI－MS正离子检测PPMP－葡寡糖衍生物的最优条件为：鞘气流速12L／min，辅助气流速1.5L／min，喷雾电压5kV，毛细管温度300℃，毛细管电压48V，透镜电压80V。同样，以PPMP标记的聚合度（Dp）为1的葡寡糖衍生物的分子离子峰［Glc＋PPMP－H］－的 m／z 376.8为基准，对MS仪负离子检测模式下的参数进行自动调谐和优化，得出ESI－MS负离子检测PPMP－葡寡糖衍生物的最优条件为：鞘气流速12L／min，辅助气流速1.5L／min，喷雾电压5kV，毛细管温度375℃，毛细管电压－48V，透镜电压－120 V。此条件下测得的PPMP衍生的葡寡糖混合物在正、负离子检测模式下的MS图示于图2。由图2可见，在PPMP衍生的葡寡糖混合物的MS图上均检出了17个分子质量相差162Da（1个葡萄糖残基）丰度明显的峰。在正离子模式检测图上依次归属为单分子PPMP衍生的聚合度（Dp）为1～17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP＋H］＋峰，在负离子模式检测图上依次归属为单分子PPMP标记的Dp1～Dp17的葡寡糖衍生物的［M＋PPMP－H］－峰。说明在单糖的衍生化条件下，PPMP和寡糖也可以实现衍生化，衍生化产物仍为单分子衍生物。图中相对分子质量为2 000以后的糖链MS信号变弱，一方面可能是由于聚合度较大的寡糖含量较低；另一方面是由于本实验使用的质谱仪在m／z 2 000以后的高质量端本身灵敏度较低。由图2还可以看出，同一聚合度寡糖的正负离子模式检测到的质谱峰能够一一对应，吻合较好，说明单分子PPMP衍生的寡糖在ESI－MS的正负离子检测模式下均有很好的响应，兼顾两者能够实现对寡糖的准确分析。据此说明PPMP衍生化可以用于寡糖样品的衍生和质谱分析。

图2 PPMP标记的maltodextrin混合物的ESI－MS图Fig.2 ESI－MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.2 PPMP标记的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC分离 为了证实单分子PPMP衍生的寡糖在反相色谱柱上的保留能力，本研究选用Symmetry Shield RP18（4.5m× 250mm，5μm）色谱柱，对PPMP标记的葡寡糖样品进行HPLC分离，梯度洗脱程序为：10%ACN （0 min）～20%ACN （60min）～50%ACN （70 min）～50%ACN （130min）＋10mmol／L NH4Ac溶液 （pH 4.5），在优化的色谱条件下得到的色谱图示于图3。由图3可见，PPMP衍生的寡糖混合物被分离为前后两组区域的峰，即0～40min内出现的I区峰和80～120min内出现的II区峰。未去除干净的PPMP在两个区域中间出峰。根据衍生原理可推测，I区峰组为单分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖只标记了1分子PPMP，衍生物的极性相对于双分子衍生物来说偏大，反相色谱保留能力相对较弱，优先出峰；而II区峰组为双分子PPMP衍生的葡寡糖，由于1分子寡糖标记了2分子PPMP，衍生物的极性较小，反相保留能力较强，因而较晚出峰。由于双分子PPMP衍生物比单分子衍生物具有高出1倍的UV响应值，尽管有少量存在，也会表现出明显的色谱信号峰。但就本实验来说，这些双分子衍生副产物与单分子衍生主产物在保留时间上相差40min，不会影响主产物的分析。由图3还可看出，I区峰组比II区峰组有较好的分离度，说明单分子PPMP衍生物比双分子PPMP衍生物更适于反相色谱模式的分离。

图3 PPMP标记的maltodextrin混合物的RP－HPLC图Fig.3 RP－HPLC chromatogram of PPMP labeled maltodextrin mixture

2.2.3 PPMP标记的葡寡糖衍生物的HPLCESI／MS在线联用分析 为了对PPMP－葡寡糖衍生物做进一步确认分析，本研究利用1.2色谱分离条件，结合2.2.1的正离子模式检测的质谱条件，设定流动相在流经UV检测器后采用分流比1∶4进入ESI－MS分析，实现对PPMP－葡寡糖衍生物的 HPLC－ESI／MS在线联用分析。对I区峰组分析的HPLC－ESI／MS联用检测图示于图4。由图4可见，HPLC上检测出的17个色谱峰，被ESI－MS依次在线检测为聚合度为Dp1～Dp17葡寡糖的单分子PPMP衍生物的分子离子［M＋H］＋、［M＋Na］＋或［M＋K］＋峰，这与2.2.1中衍生物直接进ESI－MS单独分析的结果一致。证明单分子PPMP－葡寡糖衍生物能够很好地实现HPLC和MS的在线联用分析。对II区峰组分析也得到了类似的Dp1～Dp17的双分子PPMP－葡聚糖衍生物的分子离子峰，如 m／z 617（Dp1）、m／z 779（Dp2）、m／z 941（Dp3）等 ［M＋Na］＋峰，因其 MS图信号微弱，此处省略MS图。

据此，本工作建立的PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在线联用分析葡寡糖混合物组成的方法可以为寡糖的分析提供参考。

3 结 论

在反应温度80℃，反应时间70min，PPMP过量6～7倍、氨水作为碱性介质的条件下，PPMP和葡寡糖的衍生化主产物为单分子衍生物。此单分子PPMP衍生物在ESI－MS的正负离子模式下均有较好的响应，并且混合物在RPHPLC柱上能实现很好地分离。据此，建立了PPMP柱前衍生化HPLC－ESI／MS在线联用定性分析葡寡糖混合物组成的方法，该法兼顾了HPLC的高效分离和MS的高灵敏度、定性准确的优点，具有样品处理简单、分析速度快、分析结果准确可靠等优点，可作为寡糖样品在质量控制、构效关系研究等方面的方法参考。

图4 PPMP标记的葡寡糖（maltodextrin）衍生物的HPLC－ESI／MS图（均为正离子模式检测）Fig.4 HPLC－ESI／MS profile of PPMP labeled maltodextrin mixture

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Analysis of Oligosaccharides Labeled with 1－（4－Isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone Using HPLC Coupled with On－line ESI－MS Techniques

ZHANG Ping，WANG Zhong－fu，HUANG Lin－juan
（1.Chemistry and Chemical Engineering School，Xianyang Normal University，Xianyang712000，China；2.The College of Life Sciences，Northwest University，Xi’an710069，China）

Maltodextrin was derivatized with 1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone（PPMP）in aqueous ammonia and derivatization products were analyzed by RP－HPLC separation and ESI－MS identification.The results indicated that mono－PPMP derivatives are still principal product for oligosaccharides.The mono－PPMP－derivatives for oligosaccharides from maltodextrins show satisfactory response to ESI－MS both in positive－ion mode and in negative－ion mode.The mixture of oligosaccharides derivatives with degree of polymerization 1—17was successfully separated by RP－HPLC.A new method for detecting thecomposition of oligosaccharides mixture with PPMP pre－column derivatization by HPLC coupled with on－line ESI－MS techniques was established.The method shows following merits：simple treatment for sample，fast analysis and accurate qualitation，and it can be used as a reference method for research of oligosaccharides’quality control and structure function relationship.

high performance liquid chromatography（HPLC）；electrospray ionization mass spectrometry（ESI－MS）；1－（4－isopropyl）phenyl－3－methyl－5－pyrazolone （PPMP）；derivatization；oligosaccharide

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0225－07

2012－04－05；

2012－05－30

国家自然科学基金（31170773）、陕西省科技厅自然科学基金（2012JQ2014）、陕西省教育厅自然科学基金（2010JK894）、咸阳师范学院科研基金（11XSYK103）资助

张 萍（1977～），女（汉），陕西华县人，讲师，博士，主要研究方向为糖生物学与糖化学。Email：zhp4190＠163.com

黄琳娟（1969～），女（汉），教授，博士生导师，主要研究方向为糖生物学与糖化学。E－mail：huanglj＠nwu.edu.cn