同位素稀释－超高效液相色谱－串联质谱技术分析婴儿配方奶粉中的维生素D

曹 慧，陈小珍，王 瑾，陈万勤

（浙江省质量检测科学研究院，浙江 杭州 310013）

同位素稀释－超高效液相色谱－串联质谱技术分析婴儿配方奶粉中的维生素D

曹 慧，陈小珍，王 瑾，陈万勤

（浙江省质量检测科学研究院，浙江 杭州 310013）

为了准确测定婴儿配方奶粉中维生素D的含量，建立了同位素稀释－超高效液相色谱－串联质谱联用技术分析维生素D含量的方法。样品经氢氧化钾皂化，用V（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液提取，采用Waters T3色谱柱分离，以2mmol／L甲酸铵－甲醇和2mmol／L甲酸铵－水溶液为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾－正离子电离源多反应监测模式进行定性和定量分析，内标法定量。维生素D2和维生素D3在5～150μg／L质量浓度范围内线性关系良好，维生素D2和维生素D3的检出限均为1.5μg／kg，定量限均为5.0 μg／kg，方法回收率分别为97.0%～104.7%和92.7%～108.0%，日内和日间相对标准偏差均小于10%。该方法简单、灵敏度高、分析时间短、定量准确，适用于婴儿奶粉中维生素D的测定。

同位素稀释；超高效液相色谱－串联质谱；维生素D；婴儿配方奶粉

维生素D为固醇类衍生物，具有抗佝偻病的作用，是一种重要的脂溶性维生素［1－3］。维生素D对于人体健康有诸多益处，除了可保持骨骼强健、预防软骨病外，还能起到有效治疗软骨病的功效。最新医学研究表明，童年时保证摄入足够的维生素D能降低成年后患骨质疏松症的风险。维生素D家族成员中最重要的成员是维生素D2和D3，由于它们结构相似、功能相同、色谱行为相近，对其进行有效分离和定量具有一定的难度。目前，对于维生素D的检测主要采用高效液相色谱法［4－10］，由于样品中维生素D含量低，基质干扰严重，很难对维生素D进行准确地定性和定量。有报道采用高效液相色谱－串联质谱法测定食品中的维生素D［11－18］，由于皂化和液液萃取等过程导致目标分析物不同程度的损失，基质效应在质谱分析中表现明显，因而，很难对维生素D进行准确定量。

本工作采用同位素稀释－超高效液相色谱－串联质谱技术对婴幼儿配方奶粉中的维生素D进行分析测定，在试验中加入同位素内标，避免由于皂化和萃取过程导致的目标物损失，采用内标法进行定量，消除基质效应的影响［19－21］。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

AcquityTM超高效液相色谱仪和XevoTMTQ－MS质谱仪：美国 Waters公司产品，配有电喷雾电离接口（ESI）及 Masslynx数据处理系统；Milli－Q超纯水器：美国Millipore公司产品；高速离心机：美国Thermo公司产品；氮气吹干仪：天津市恒奥科技有限公司产品；往复式恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司产品；涡旋混合器：太仓市华利达实验设备有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Meker公司产品；异辛烷、乙醚、正戊烷：色谱纯，美国Tedia公司产品；婴儿配方奶粉：市售品；维生素D2和维生素D3标准品：美国pharmacopeia公司产品；维生素 D2－2H3（1mg）和维生素 D3－2H3（1g／L，1 mL）标准品：美国IsoSciences LLC公司产品。

标准溶液的配制：分别准确称取10mg维生素D2和维生素D3标准品于10mL容量瓶中，用异辛烷定容，配置成1g／L的储备液，密封储存于－20℃冰箱中。分别吸取1g／L的维生素D2和维生素D3标准溶液50μL于50mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1mg／L的混合标准溶液，用时稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。

内标溶液的配制：取1mg维生素D2－2H3标准品于10mL容量瓶中，用异辛烷定容，配置成100mg／L的储备液，密封储存于－20℃冰箱中。取1mL浓度为1g／L的维生素D3－2H3标准品于10mL容量瓶中，用异辛烷定容，配置成100mg／L的储备液，密封储存于－20℃冰箱中。分别吸取100mg／L的维生素D2－2H3和维生素D3－2H3标准溶液100μL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配置成1mg／L的混合内标溶液。

1.3 试验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱2.1mm×100mm，粒径1.8 μm；柱温：35℃；样品温度：25℃；进样体积：5 μL；流速：0.3mL／min；流动相：2mmol／L甲酸铵甲醇（A），2mmol／L甲酸铵水混合溶液（B）；洗脱程序：0～1min，95%A，3～6min，100%A，7～10min，95%A。

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：20V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1 000L／h。

1.4 前处理方法

称取2g试样于离心管中，加入100μL浓度为1mg／L的混合内标溶液、0.4g抗坏血酸和10mL水，涡旋混合均匀，再加入6mL甲醇和5mL 45%的氢氧化钾溶液，置于75℃水浴中，振摇皂化30min后转移入分液漏斗，用22 mLV（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液和6mL乙腈萃取，有机相经水洗至中性，在40℃下氮气吹至干，加入2mLV（甲醇）∶V（水）＝95∶5的混合溶液溶解。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

分别选取5种不同长度、不同型号的色谱柱分离维生素D2和维生素D3，使用标准工作溶液对各规格色谱柱进样分离得色谱质谱图，其中Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1mm×100 mm，1.8μm）的峰形和分离效果最好，这是由于T3色谱柱可以提高极性化合物的保留并与纯水相流动相兼容，使峰形对称且稳定。Waters Acquity UPLC BEH Hilic（2.1mm×100mm，1.7 μm）色谱柱要求高比例有机相，水相比例极小，不适合维生素D类物质的分析。Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7μm）色谱柱由于长度太短，干扰严重，且维生素D2和维生素D3不能有效分离。Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）和Waters Acquity UPLC BEH C8（2.1mm×100 mm，1.7μm）色谱柱由于不能完全兼容纯水相流动相，峰形拖尾较严重且分离效果不好。

选取 Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100mm，1.8μm）色谱柱，分别选择甲醇和乙腈作为强洗脱流动相。试验证明：当乙腈作流动相时，离子化受到不同程度的抑制，丰度明显降低，导致灵敏度下降，而甲醇的离子化效率明显优于乙腈，故本试验采用甲醇强洗脱流动相。在流动相中加入甲酸铵能增加维生素D2和维生素D3在ESI＋模式下的离子化效率。本试验分别配制1、2和5mmol／L的甲酸铵－甲醇和甲酸铵－水作为流动相，试验表明，2mmol／L的甲酸铵体系能提供最佳离子化条件，峰面积信号最强，灵敏度最高。图1为维生素D2和维生素D3混合标准溶液的MRM色谱图。

2.2 质谱条件的优化

在电喷雾质谱、正离子监测模式下，分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择离子等进行了充分的优化，选取经碰撞后所得丰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。最终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数列于表1。

2.3 前处理方法的优化

采用V（正戊烷）∶V（乙醚）＝4∶1的混合溶液作为萃取溶剂，与乙醚或石油醚相比，具有提取效率高、回收稳定等优点；在萃取试剂中加入乙腈溶液，有利于萃取后两相分层，不利于乳化。在前处理过程中加入了同位素内标，避免了由于多次液液萃取造成的损失，提高了定量分析的准确性。

图1 维生素D2和维生素D3的MRM色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of vitamin D2and vitamin D3

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围和检出限 取浓度分别为5、10、25、50、100、125、150μg／L的一系列标准溶液，以峰面积（y）对相应的质量浓度（x）作图，得标准曲线，示于图2，并求出相应的线性回归方程及相关系数，结果列于表2。结果表明：维生素D2和维生素D3在5～150μg／L的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r2均在0.999以上。按3倍信噪比计算得到样品中维生素D2和维生素D3的检出限为1.5μg／kg，定量限为5.0μg／kg。

2.4.2 精密度和稳定性实验 在不含有维生素D2和D3的奶粉样品基质中添加20μg／kg浓度水平的维生素D2和维生素D3标准溶液，按1.4方法进行预处理，平行操作7次，进行分析，维生素D2和维生素D3的RSD分别为1.07%和0.77%。按日内精密度的预处理方法，每天取样1份，连续测定7天，维生素D2和维生素D3的RSD分别为6.82%和5.63%，该试验重现性较好。

2.4.3 回收率实验 分别在不含有维生素D2和D3的奶粉样品基质中添加5、10、20和100 μg／kg 4种不同浓度的维生素D2和维生素D3标准溶液，按1.4方法进行预处理，回收率列于表3。结果表明：维生素D2的回收率在97.0%～104.7%，维生素 D3的回收率在92.7%～108.0%。

图2 维生素D2和维生素D3的校正曲线Fig.2 Calibration curve of vitamin D2and vitamin D3

2.5 实际样品的测定

对市场上3批婴儿配方奶粉，根据1.4方法进行测定，每批平行测定3次，结果列于表4。

表2 维生素D2和维生素D3的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，LOD and LOQ of vitamin D2and vitamin D3

表3 维生素D2和维生素D3的回收率结果（n＝3）Table 3 Results of recoveries of vitamin D2and vitamin D3

表4 维生素D2和维生素D3的测定结果Table 4 Testing results of vitamin D2and vitamin D3

3 结 论

本工作建立了超高效液相色谱－串联质谱法测定婴儿配方奶粉中的维生素D2和维生素D3含量。该方法具有灵敏度高、前处理方法简单、回收率高且稳定、准确度和精密度高等优点，由于在前处理方法中加入了同位素内标，与国家标准方法相比，样品消耗量少，萃取效率高，能有效地去除基质干扰，定量结果的准确性更高。

［1］ WANG S H.Epidemiology of vitamin D in health and disease［J］.Nutrition research reviews，2009，22（2）：188－203.

［2］ BLUM M，DOLNIKOWSKI G，SEYOUM E，et al.Vitamin D3in fat tissue［J］.Endocrine，2008，33（1）：90－94.

［3］ PERALES S，DELGADO M M，ALEGRIA A，et al.Liquid chromatographic determination of Vitamin D3in infant formulas and fortified milk［J］.Analytica chimica acta，2005，543（1／2）：58－63.

［4］ 赵 榕，薛 颖，吴国华，等.固相萃取－高效液相色谱法测定钙强化食品中的维生素D［J］.色谱，2008，26（1）：113－115.

［5］ 仲宣惟，夏 瑞，施 捷.HPLC法测定保健食品中维生素D2、D3的含量［J］.药物分析杂志，2007，27（11）：1 773－1 774.

［6］ 梁晓艳.高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量［J］.广西中医学学报，2007，10（2）：58－61.

［7］ 谭青松，付 洁，何瑞国.高效液相色谱法测定鱼样中的维生素A、维生素D3和维生素E［J］.动物营养学报，2007，19（5）：636－640.

［8］ 曹晶萍，陈海波，高 颖.高效液相色谱法同时测定人血清中维生素A、D3、E的含量［J］.中国医院药学杂志，2008，28（10）：804－806.

［9］ 曾红燕，邹晓莉.HPLC同时测定保健食品中维生素 A、D、E和β－胡萝卜素［J］.分析试验室，2008，27（2）：15－18.

［10］ 刘红河，尹江伟，仲岳桐.HPLC－DAD同时测定食品中维生素A、D、E研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，9（15）：1 047－1 049.

［11］ HEUDI O，TRISCONI M J，BLAKE C J.Simultaneous quantification of Vitamins A，D3and E in fortified infant formulae by liquid chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of chromatography A，2004，1022（1／2）：115－123.

［12］ 黄 芳，吴惠勤，杭义萍.高效液相色谱－串联质谱法测定食品中维生素D2和维生素D3［J］.理化检验－化学分册，2011，47（5）：577－579.

［13］ BYRDWELL W C.Comparison of analysis of vitamin D3in foods using ultraviolet and mass spectrometric detection［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（6）：2 135－2 146.

［14］ HUANG M，WINTERS D.Application of ultraperformance liquid chromatography／tandem mass spectrometry for the measurement of vitamin D in foods and nutritional supplements［J］.Journal of AOAC International，2011，94（1）：211－223.

［15］ TRENERRY V C，PLOZZA T，CARIDI D，et al.The determination of vitamin D3in bovine milk by liquid chromatography mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2011（125）：1 314－1 319.

［16］ ARONOV P A，HALL L M，DETTMER K，et al.Metabolic profiling of major vitamin D metabolites using Diels－Alder derivatization and ultra－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2008，391（5）：1 917－1 930.

［17］ DIMARTINO G.Simultaneous determination of cholecalciferol（vitamin D3）and ergocalciferol（vitamin D2）in foods by selected reaction monitoring［J］.Journal of AOAC International，2009，92（2）：511－517.

［18］ DIMARTINO G.Convenient analysis of vitamin D in cheese and other food matrixes by liquid chromatography／mass spectrometry［J］.Journal of AOAC International，2007，90（5）：1 340－1 345.

［19］ 申玉星，全 灿，马 康.液相色谱－同位素稀释质谱法准确测定人血清中葡萄糖含量［J］.质谱学报，2011，32（4）：211－219.

［20］ 宁啸骏，王丁林，虞成华，等.UPLC－MS／MS同位素内标法测定食品中对位红、苏丹红Ⅰ～Ⅳ的研究［J］.质谱学报，2009，30（1）：41－46.

［21］ PHINNEY K W，RIMMER C A，THOMAS J B，et al.Isotope dilution liquid chromatography－mass spectrometry methods for fat－and water－soluble vitamins in nutritional formulations［J］.Analytical Chemistry，2011，83（1）：92－96.

Determination of Vitamin D in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry with Isotopes Dilution

CAO Hui，CHEN Xiao－zhen，WANG Jin，CHEN Wan－qin
（Zhejiang Institute of Quality Inspection Science，Hangzhou310013，China）

In order to establish a reliable method for quantitative analysis of vitamin D in infant milk powder，a ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC／MS／MS）with isotopes dilution method was developed.The samples were saponifed with KOH and extracted by pentane－ethyl ether solution（V（pentane）∶V（ethyl ether）＝4∶1）.The target analytes were separated on the Waters T3column with gradient elution using methanol and water（containing 2mmol／L ammonium formate for both）as mobile phase.The identification and quantification were achieved by using electrospray ionization in positive ion mode and with multiple reaction monitoring.Internal standard method was used to determine the results.The linear range of the calibration curve was 5—150μg／L.The limit of detection（LOD）of the method was 1.5μg／kg，and the limit of quantitation（LOQ）was 5.0μg／kg.The recoveries of the method were in the range of 97.0%—104.7%and 92.7%—108.0%for vitamin D2and vitamin D3respectively.The relative standard deviations（RSD）of intra－day and inter－day were less than 10%.The simply，rapid，accurate and sensitive method can be applied to determine the vitamin D in infant milk powder.

isotopes dilution；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）；vitamin D；infant milk powder

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0232－05

2012－04－09；

2012－06－03

浙江省科技厅分析测试科技计划（2011C37072）、浙江省质量技术监督系统科研计划（20110203）项目资助

曹 慧（1980～），女（汉），浙江湖州人，博士，工程师，主要从事色谱和质谱检测与科研工作。E－mail：ch＿zj＿cn＠163.com

陈小珍（1960～），女（汉），浙江杭州人，教授级高级工程师，主要从事食品检测与研究工作。E－mail：cxz730＠163.com