液相色谱－串联质谱法测定尿液中的可替宁

刘 彤，侯宏卫，张小涛，陈 欢，唐纲岭，胡清源

（国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001）

液相色谱－串联质谱法测定尿液中的可替宁

刘 彤，侯宏卫，张小涛，陈 欢，唐纲岭，胡清源

（国家烟草质量监督检验中心，河南 郑州 450001）

为了准确测定吸烟者与非吸烟者尿液中可替宁含量水平，建立了液相色谱－串联质谱（LC－MS／MS）测定方法。尿液经稀释、离心和过滤，引入LC－MS／MS，经 Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18色谱柱（150mm×2.1mm，3.5μm）分离，以0.1% 甲酸水溶液－0.1% 乙酸甲醇溶液为流动相，采用梯度洗脱方式，以电喷雾离子源正离子多反应监测模式进行分析。方法检出限为0.08μg／L，线性范围为1～500μg／L，空白样品中加标回收率范围在94.3%～99.9%，精密度（以相对标准偏差计）为0%～3.2%。利用此方法检测了58个非吸烟者和246个吸烟者尿液中可替宁的含量水平，结果表明：吸烟者24h尿液中的可替宁含量是非吸烟者的180多倍，但是由于个体之间以及吸烟行为之间的差异，尿液中的可替宁含量并不随卷烟主流烟气中烟碱含量的升高而升高。

可替宁；高效液相色谱－串联质谱；尿液；中国烤烟型卷烟

烟碱，俗称尼古丁，是一种存在于茄科植物（茄属）中的生物碱，也是烟草的重要成分，占烟草中总生物碱的98%［1］。烟碱是烟草的主要活性成分，也是导致吸烟成瘾或产生依赖性的主要因素［2］。进入人体内的尼古丁约80%在肝脏中的细胞色素酶P4502A6的作用下代谢为可替宁［3］，其结构示于图1。可替宁随血液进入到人体各个部位，在血液［4－5］、尿液［6］、唾液［1］等体液和肝脏及脑等器官中均发现可替宁的分布。可替宁在体内的半减期为18～22h，且由于尼古丁是可替宁的唯一来源，因此是目前公认的评价卷烟烟气暴露的特异性生物标志物［4］。

图1 可替宁的结构式Fig.1 The structure of cotinine

由于尿液具有非创伤性、来源广等特点，被广泛的用来评价卷烟烟气暴露情况。分析尿液中可替宁的方法主要有：酶联免疫法［7］、毛细管电泳化学发光法［8］、气相色谱－质谱法［9］、液相色谱法［10－12］和液相色谱－串联质谱法 （LC－MS／MS）［6，11，13－19］。LC－MS／MS比传统的分析方法灵敏度更高，选择性更强，但往往需要繁琐的液液萃取［13－14］或 者固相 萃取［15］来净化尿液样本。Fan等［17］建立了一个直接稀释过滤进样分析尿液中可替宁的LC－MS／MS方法，此方法简化了前处理过程，选取了一根常规的液相色谱柱（柱径：4.6mm，粒径：5μm），但其分离的效果不如小粒径、窄内径的质谱色谱柱；且过大的流速（1 mL／min）会增加有机溶剂和雾化气体的损耗。本研究旨在建立一种简单、快速、选择性好的测定尿液中的可替宁的LC－MS／MS方法，用于中国烤烟型卷烟吸食人群尿液中可替宁的测定，为吸烟人群尿液中可替宁含量水平评估提供数据支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1200型液相色谱：美国Agilent公司产品，配有G1329A自动进样器，G1311A四元混合泵和G1316A柱温箱；API4000三重四级杆串联质谱仪：美国应用生物系统公司产品，配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.5软件数据处理系统。

可替宁，可替宁－d3：纯度均为98%，同位素纯度均为99%，Toronto Research Chemicals Inc公司产品；甲醇和乙酸：美国Tedia公司产品；所有的溶剂均为色谱纯；实验用水均为去离子水。

1.2 标准工作液的配制

称取14.3mg可替宁标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1.43g／L的可替宁甲醇溶液。准确移取69μL上述储备液于10 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到10mg／L的可替宁水溶液。量取1mL 10mg／L的可替宁水溶液，用水定容到10mL，得到1mg／L的可替宁水溶液。

称取10mg可替宁－d3标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1g／L的可替宁－d3甲醇溶液。准确移取100μL上述储备液于10mL容量瓶中，用超纯水定容，得到10mg／L的可替宁－d3水溶液。

1.3 尿液样品的收集

吸烟和非吸烟志愿者尿液样本由郑州大学国家药品临床研究基地提供。所有志愿者在参加试验前均须签署一份知情同意书，志愿者为年龄在2l～60岁之间身体健康的吸烟和非吸烟者。其中吸烟者分为3组，分别吸食焦油释放量为8mg烤烟型卷烟、10mg烤烟型卷烟和13 mg烤烟型卷烟，每人每天15支烟，收集其24h尿液，储存于－40℃冰箱中备用。

1.4 样品处理

尿液样品于室温下解冻，混合均匀后，取100μL的尿液，加入20μL的氘代内标，加入880μL纯水，以10 000r／min离心10min。离心的上清液过0.22μm聚醚砜水相滤膜，取5 μL滤液引入LC－MS／MS分离分析。

1.5 试验条件

1.5.1 色谱条件 Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18色谱柱（150mm×2.1mm，3.5μm）；流动相 A：0.1% 甲酸水溶液；流动相B：0.1%乙酸甲醇溶液；柱温40℃；进样量5μL。梯度洗脱条件：0～2min，30%B；2～5min，90%B；5～7min，30%B；7～8min，30%B；流速为200 μL／min时洗脱尿液样品，分析时间为8min。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：5 000V；雾化气压力：348kPa；气帘气压力：209kPa；辅助加热气压力：348kPa；温度：500 ℃；碰撞电压：10 eV；去簇电压：58V；驻留时间：100ms。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

用蠕动泵以10μL／min的流速连续注射，将质量浓度为50μg／L的可替宁标准溶液注入ESI离子源中，在正离子模式下对可替宁进行一级质谱扫描，得到可替宁的准分子离子峰［M＋H］＋，然后对此准分子离子峰进行子离子扫描，得到碎片离子信息。选取丰度较强、干扰较小的m／z177.2、m／z 98.0作为定量离子对，m／z 177.2、m／z80.1为确认离子对，m／z 180.2、m／z80.1为对应的氘代内标离子对（可替宁－d3）。为了达到更高的灵敏度，对碰撞能量、去簇电压等参数进行了优化，优化结果为：最优的碰撞能量为10eV，去簇电压为58V，驻留时间为100ms。

2.2 色谱条件的优化

范忠［16］等采用 Agilent Eclipse XDB C18柱（150mm×4.6mm，5μm），以10mmoL／L（pH 6.8）乙酸铵水溶液和无水甲醇为流动相测定了吸烟者和被动吸烟者尿液中的烟碱及其代谢物，其中可替宁的保留时间为6.41min。为了改善峰形和缩短分析时间、减少有机溶剂和雾化器的消耗，选取了一根小粒径、窄内径的色谱柱。为了调整可替宁的保留时间并且尽量减少杂质峰的干扰以获得更好的峰形，采用1.5的梯度洗脱方法，在此条件下可替宁及其氘代内标的保留时间为2.63min，分析物在稀释十倍尿液中峰型较好，基质效应小于10%。可替宁及其氘代内标在尿液样品中的色谱图示于图2。

图2 空白样本中可替宁及氘代内标的总离子流图（a），空白样本加标以后可替宁及氘代内标的总离子流图（b），实际样本中可替宁及氘代内标的总离子流图（c），其中可替宁浓度为22.5μg／LFig.2 Total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a blank urine（a）；total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a blank urine added standard（b）；total iron chromatograms of cotinine and internal standard in a smoker urine（c）

2.3 标准曲线和检出限

将可替宁的标准溶液分别稀释成1、2、5、10、50、100和500μg／L的标准工作溶液，在优化的LC－MS／MS条件下进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，其回归方程为y＝0.024 2x＋0.009 98，标准曲线相关系数r为1.000 0。结果表明，目标分析物在质量浓度1～500μg／L内具有良好的线性关系。以3倍信噪比对应的目标物浓度作为检出限（LOD），该方法的LOD为0.08μg／L。

2.4 回收率和精密度

采用尿液基质加标准品的方法测方法的回收率。选取一个非吸烟者尿液样本，选取3个添加水平（5，100和400μg／L）加入标准品，每个浓度平行做5次重复试验，得到方法的回收率和精密度（以相对标准偏差（RSD）计），结果列于表1。方法的回收率范围是94.3%～99.9%，RSD为0%～3.2%。由于尿液只是经过简单的稀释、离心和过滤处理，其中残留的蛋白质及盐类的影响，可能会造成回收率略低，但从现有数据看，该方法比较可靠。

表1 方法的回收率和精密度（n＝5）Table 1 Recovery and RSD of the LC－MS／MS method

2.5 方法应用

利用本研究建立的方法，对304个尿液样本（其中非吸烟者58人；吸食焦油释放量为8mg烤烟型卷烟82人；吸食焦油释放量为10mg烤烟型卷烟82人；吸食焦油释放量为13mg烤烟型卷烟82人；吸烟者每人每天抽吸15支烟）中的可替宁含量进行了检测。剔除3个离群值（t检验）以后，尿液中24h可替宁含量结果示于图3，非吸烟者尿液中可替宁的含量范围为0～36.74μg／24h，平均值为 4.15μg／24h（n＝57）；吸食8mg卷烟者尿液中可替宁的含量范围为24.01～3066.25μg／24h，平均值为892.35 μg／24h（n＝82）；吸食10mg卷烟者尿液中可替宁的含量范围为1.51～3599.04μg／24h，平均值为782.28μg／24h（n＝81）；吸食13mg卷烟者尿液中可替宁的含量范围为24.28～2915.50 μg／24h，平均值为862.50μg／24h（n＝81）。

可替宁具有烟气特异性，非吸烟者24h尿液中的可替宁可能是来源于环境烟气的暴露；吸烟者24h尿液中的可替宁含量明显高于非吸烟者（约为180倍）。3种不同焦油含量的卷烟主流烟气中烟碱的含量在ISO条件测定分别为0.8mg（焦油8mg卷烟）、1.1mg（焦油10mg卷烟）和1.2mg（焦油13mg卷烟）。然而尿液中的可替宁并不随卷烟主流烟气中尼古丁含量的升高而升高，这可能是由于个体之间以及吸烟行为之间的差异：单口之间的抽吸容量和抽吸频率都会影响尼古丁的暴露剂量，此外还与吸烟者吸烟时间以及成瘾性的大小有关，烟瘾大的人吸食低焦油的卷烟时可能会存在补偿抽吸［20］，最终影响尿液中可替宁的含量。

图3 301个24h尿液样品可替宁含量的箱线图Fig.3 Boxplots of cotinine concentrations for 301human 24hurine samples

3 结 论

本工作建立了一种简单、快速、选择性好的测定尿液中可替宁的LC－MS／MS方法。样品经稀释、离心和过滤后直接进样分析，方法的回收率范围是94.3%～99.9%，检出限为0.08 μg／L。利用此方法检测了58个非吸烟者和246个吸烟者尿液中可替宁的含量水平，吸烟者24 h尿液中的可替宁含量明显高于非吸烟者。

［1］ KATAOKA H，INOUE R，YAGI K，et al.Determination of nicotine，cotinine，and related alkaloids in human urine and saliva by automated intube solid－phase microextraction coupled with liquid chromatography－mass spectrometry ［J］.J Pharm Biomed Anal，2009，49（1）：108－114.

［2］ BENOWITZ N L.Pharmacologic aspects of cigarette smoking and nicotine addiction［J］.N Engl J Med，1988，319：1 318－1 330.

［3］ MESSINA E S，TYNDALE R F，SELLERS E M.A major role for CYP2A6in nicotine c－oxidation by human liver microsomes［J］.J Pharmacol Ex Ther，1997.282（3）：1 608－1 614.

［4］ 王 俊，宋瑞金.人体内可替宁检测技术研究进展［J］.环境与 健 康 杂 志，2008，25（12）：1 111－1 113.

［5］ IWASAKI Y，GOTO M，MOCHIZUKI K，et al.Development and validation of a hydrophilic interaction chromatography－tandem mass spectrometry for quantification of nicotine and its metabolites in human maternal and cord sera ［J］.Biomedical chromatography：BMC，2011，25（4）：503－513.

［6］ MARCLAY F，SAUGY M.Determination of nicotine and nicotine metabolites in urine by hydrophilic interaction chromatography–tandem mass spectrometry：Potential use of smokeless tobacco products by ice hockey players［J］.J Chromatogr A，2010，1217（48）：7 528－7 538.

［7］ KUO H W，YANG J S，CHIU M C.Determination of urinary and salivary cotinine using gas and liquid chromatography and enzyme－linked immunosorbent assay［J］.J Chromatogr B，2002，768：297－303.

［8］ SUN J Y，DU H W，YOU T Y.Determination of nicotine and its metabolite cotinine in urine and cigarette samples by capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence［J］.Electrophoresis，2011，32（16）：2 148－2 154.

［9］ LAFAY F，VULLIET E，FLAMENT－WATON M M.Contribution of microextraction in packed sorbent for the analysis of cotinine in human urine by GC－MS［J］.Anal Bioanal Chem，2009，396（2）：937－941.

［10］ YANG J，HU Y，CAI J B，et al.A new molecularly imprinted polymer for selective extraction of cotinine from urine samples by solid－phase extraction［J］.Anal Bioanal Chem，2006，384（3）：761－768.

［11］ PETERSEN G O，LEITE C E，CHATKIN J M，et al.Cotinine as a biomarker of tobacco exposure：development of a HPLC method and comparison of matrices［J］.J Sep Sci，2010，33（4／5）：516－521.

［12］ WEN Y H，YANG P S，WU S S.Determination of cotinine in human urine by high－performance liquid chromatography［J］.J Food Drug Anal，2009，17（5）：357－362.

［13］ GABR R Q，ELSHERBINY M E，SOMAYAJI V，et al.A liquid chromatography－mass spec－trometry method for nicotine and cotinine；utility in screening tobacco exposure in patients taking amiodarone［J］.Biomed Chromatogr，2011，25（10）：1 124－1 131.

［14］ APINAN R，CHOEMUNG A，NABANGCHANG K.A sensitive HPLC－ESI－MS－MS method for the determination of cotinine in urine［J］.J Chromatogr Sci，2010，48：460－465.

［15］ MILLER E I，NORRIS H Y K，ROLLINS D E，et al.A novel validated procedure for the determination of nicotine，eight nicotine metabolites and two minor tobacco alkaloids in human plasma or urine by solid－phase extraction coupled with liquid chromatography－electrospray ionizationtandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2010，878（9／10）：725－737.

［16］ 范 忠，刘惠民，谢复炜，等.LC－MSMS法测定吸烟者和被动吸烟者尿液中的烟碱及其代谢物［J］.烟草科技，2008，（9）：39－42.

［17］ FAN Z，XIE F W，XIA Q L，et al.Simultaneous determination of nicotine and its nine metabolites in human urine by LC－MS－MS［J］.Chromatographia，2008，68（7／8）：623－627.

［18］ DOBRINAS M，CHOONG E，NOETZLI M，et al.Quantification of nicotine，cotinine，trans－3＇－hydroxycotinine and varenicline in human plasma by a sensitive and specific UPLC－tandem massspectrometry procedure for a clinical study on smoking cessation［J］.Journal of chromatography B，Analytical technologies in the biomedical and life sciences，2011，879（30）：3 574－3 582.

［19］ WU C F，UANG S N，CHIANG S Y，et al.Simultaneous quantitation of urinary cotinine and acrylonitrile－derived mercapturic acids with ultraperformance liquid chromatography－tandem mass spectrometry ［J］.Anal Bioanal Chem，2012，402（6）：2 113－2 120.

［20］ MUHAMMAD－KAH R，LIANG Q W，FROSTPINEDA K，et al.Factors affecting exposure to nicotine and carbon monoxide in adult cigarette smokers［J］.Regul Toxicol Pharmacol，2011，61（1）：129－136.

Determination of Cotinine in Urine Using High Performance Liquid Chromatography－Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry

LIU Tong，HOU Hong－wei，ZHANG Xiao－tao，CHEN Huan，TANG Gang－ling，HU Qing－yuan
（China National Tobacco Quality Supervision ＆ Test Centre，Zhengzhou450001，China）

A high performance liquid chromatography－electrospray ionization tandem mass spectrometry（LC－ESI－MS／MS）method was developed for the determination of cotinine in urine.After dilution，centrifugation and filtration，the urine was injected to the LC－MS／MS.The analysis was performed on a Agilent Zorbax Eclipse XDB－C18column（150mm×2.1mm，3.5μm）using agradient elution with the mobile phases of 0.1%formic acid buffer and 0.1%acetate in methanol（V／V），and determined by tandem mass spectrometry in positive ESI mode under multiple reaction monitoring mode.The limits of determination（S／N＝3）was 0.08μg／L，with a linear calibration range spanning 1—500μg／L.The recoveris ranged from 94.3%to 99.9%at three spiked levels，the relative standard deviations（RSDs）ranged from 0to 3.2%.The method was applied to detect the concertrationof urine cotinine from 58non－smokers and 246smokers.Twenty－four hours urine cotinine levels in smokers was much more than 180times that in non－smokers.However，due to the differences between individuals and smoking behavior，the concertration of urine cotinine did not increase with cigarettes nicotine in the mainstream smoke.

cotinine；liquid chromatography－tandem mass spectrometry；urine；Chinese virginia cigarettes

O 657.63

A

1004－2997（2012）04－0252－05

2012－03－02；

2012－04－28

国家烟草质量监督检验中心科研项目（2010JC11）资助

刘 彤（1968～），女（汉），河南郑州人，工程师，从事烟草化学、吸烟与健康研究。E－mail：xiaodew＠hotmail.com

侯宏卫（1975～），男（汉），陕西凤翔人，高级工程师，从事烟草化学、生物标志物、吸烟与健康研究。

E－mail：hou＿hongwei＠yahoo.com.cn

胡清源（1965～），男（汉），山东淄博人，研究员，从事烟草化学、生物标志物、吸烟与健康研究。E－mail：huqy＠ztri.com.cn