TRAIL与环磷酰胺诱导LN215细胞凋亡的作用

2012-09-18 07:33张艳春赵东海于洪泉
中国老年学杂志 2012年18期
关键词:细胞株胶质瘤恶性

张艳春 齐 玲 严 海 金 宏 赵东海 于洪泉

(北华大学第二附属医院麻醉科,吉林 吉林 132013)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)作为一种新型的抗肿瘤药物,在美国已进入临床Ⅱ期实验阶段〔1〕。前期的研究发现,在某些恶性胶质瘤的死亡信号诱导复合体(DISC)成分中,半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、死亡受体5(DR5)具有十分重要的作用〔2~4〕。因此,继续研究其他恶性胶质瘤细胞对TRAIL的敏感性及耐药的机制,可为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供更充分的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM/F12培养基、小牛血清、0.25%胰酶(美国Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech公司);对硝基苯(上海生物工程技术公司);环磷酰胺(CPA,阿拉丁公司,中国)。

1.2 细胞培养 将配制好的DMEM/F12培养基置于培养箱中预热,自液氮罐中取出人恶性胶质瘤细胞系LN215,迅速置于37℃水浴至融化,离心后小心吸出上清,将细胞用1 ml培养基混匀放入培养皿中,再加入9 ml新鲜培养基,轻轻混匀后放入5%CO2、37℃培养箱中,在饱和湿度下培养。待80% ~90%融合时进行传代。

1.3 酸性磷酸酶法检测TRAIL对恶性胶质瘤细胞的诱导凋亡作用 待细胞融合至80%左右,胰酶消化后台盼蓝计数活细胞,以8×103个/孔密度接种于96孔板中,培养24 h,加入不同浓度 TRAIL(0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,100,300 ng/ml),对照组使用基础培养基。24 h后小心弃上清,磷酸盐缓冲液(PBS)洗去培养基,每孔加入酸性磷酸酶底物检测液(对硝基苯新鲜配制)100 μl,继续培养90 min,加入终止液,室温下孵育5 min。酶标仪405 nm处测定各孔光吸收值。

1.4 酸性磷酸酶法检测TRAIL与CPA对恶性胶质瘤细胞诱导凋亡作用 将细胞以8×103个/孔接种于96孔板培养24 h后,将细胞分为四组,分别为TRAIL组(TRAIL 100 ng/ml),CPA 组(CPA 10 μg/ml),联合用药组(TRAIL 100 ng/ml+CPA 10 μg/ml),对照组(基础培养基)。余步骤同1.3。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析,实验数据以±s表示,组间比较用t检验,P<0.01为差异有显著性。

2 结果

2.1 LN215细胞的培养 恶性胶质瘤细胞株LN215复苏后培养,细胞在复苏2 h开始贴壁,初期呈现圆球形,随着时间的延长,细胞逐渐出现突起,开始呈现长梭形,24 h后90%以上的细胞都已贴壁,大部分可见明显的突起。

2.2 LN215细胞对TRAIL的敏感性 图1可见。经不同浓度TRAIL作用后,细胞最初在TRAIL低浓度时无明显的凋亡发生,甚至出现轻微的增殖现象;但当TRAIL浓度达到1 ng/ml时,细胞开始出现凋亡,并随TRAIL浓度升高,凋亡水平逐渐升高,在300 ng/ml时,凋亡率可达到12%。从 TRAIL作用于LN215细胞的结果来讲,LN215是对TRAIL抵抗的细胞株。

图1 TRAIL诱导LN215细胞发生凋亡情况

2.3 TRAIL联合CPA诱导LN215细胞凋亡作用 LN215细胞经TRAIL作用后,测定结果为0.29±0.02,CPA作用后检测结果为0.23±0.01,TRAIL与CPA联合作用检测结果为0.11±0.01,与对照组(0.29±0.02)相比具有显著性差异(P<0.01)。

3 讨论

自2007年以来,癌症已成为危胁人类生命健康的最大杀手。癌症的最佳治疗目标是触发肿瘤发生自发选择性细胞死亡,而不引起其他组织的损伤。然而,在癌细胞不断追求生存、阻碍细胞死亡的进程中,往往会发生肿瘤细胞耐药,这就是癌症对放疗和化疗发生抵抗的原因〔5〕。TRAIL可选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡,对正常的组织细胞没有明显的毒性作用〔1〕。

研究表明,大部分恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡发生耐药〔6〕。本研究也发现,因此,LN215是TRAIL耐药细胞株。进一步研究TRAIL与化疗药物CPA是否发生协同作用,联合用药组细胞发生明显的凋亡反应,而单独用药组则不出现这种反应,这一结果有力地证实了TRAIL与化疗药物可发生协同作用。但TRAIL与化疗药物发生协同作用的机制还需要进一步研究。

1 Bellail AC,Qi L,Mulligan P,et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials,2009;4(1):34-41.

2 Qi L,Bellail AC,Rossi MR,et al.Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis,2011;16(11):1150-64.

3 齐 玲,于洪泉,金 宏,等.Caspase-8在胶质母细胞瘤抵抗TRAIL诱导凋亡中的作用〔J〕.吉林大学学报(医学版),2011;37(4):612-6.

4 南栗岩,齐 玲,肖振晶,等.原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(18):3591-2.

5 Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med,2005;352(10):987-96.

6 Li YC,Tzeng CC,Song JH,et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res,2006;12(9):2716-29.

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