影响绵羊受精卵冷冻和解冻后生存性的主要因素

全晓毅

青海省贵南县兽医站，青海贵南813100

受精卵冷冻保存和解冻后移植是家畜体外授精技术应用于生产的关键环节。家畜的种类、受精卵发育阶段、冷冻剂和解冻剂的选择、冷冻和解冻的温度和速度等，均会影响受精卵的成活率和囊胚发育。本文就影响冷冻绵羊受精卵解冻后生存性的主要因素加以讨论，探索绵羊受精卵的冷冻保存及解冻后移植的有效途径。

1 经冷冻的绵羊受精卵解冻后生存性的研究概况

1974年Willadsen等①最先发表移植冷冻保存绵羊受精卵并获得受胎的报告。Willadsen等在绵羊受精后第5～8天采取受精卵，用1.5mol／L的二甲基亚砜（DMSO）以0.3℃／min的速度降温；在液氮中保存0.5～30.0d后，用12.0℃／min的速度解冻；将18个受精卵为11只绵羊移植，在移植后的第3个月检查，确定7只受胎。Smorag①将15个受精卵进行冷冻和解冻，为8只绵羊移植，其中4只受胎，且产了5只羔羊。王志清等［1］在绵羊受精后第5～7天采取具16个胚囊的受精卵，用1.5～2.0 mol／L的DMSO作抗冻剂，以0.21～1.00℃／min的速度降温到－76℃，在液氮中保存4～21d；再以4℃／min和12℃／min的速度解冻，检查发现保存的21个受精卵大部分变性。

2 保存液和抗冻液

采取受精卵用保存液处理10min后，移入冷冻保护液中平衡20min，再放入有少量保存液的小试管、安瓿或塑料细管中，并置胚胎冷冻机中进行冷冻。冷冻保存受精卵用的抗冻剂以1.5～2.0 mol／L的DMSO 为主，甘油用1.0mol／L。在小白鼠、大白鼠和田鼠受精卵的冷冻保存中，用乙二醇或二甲基甲酰胺作抗冻剂，与DMSO有同样的效果。1984年Tervit等①在研究中发现，乙二醇作为绵羊冷冻保护剂的冷冻效果明显优于甘油。不同冷冻剂对不同时期的受精卵具有不同保护作用，乙二醇对山羊处于桑椹胚期的受精卵冷冻效果较好，甘油对山羊处于囊胚期的受精卵冷冻效果较好［2］。抗冻剂采用分次逐渐提高浓度的方法添加。

3 降温和植冰

一般添加了抗冻剂的样品，在0℃或－3～－7℃之前以1℃／min左右的速度降温，诱发样品内形成结晶样的操作叫做植冰。安志兴等［3］对不同植冰温度下几种冷冻液的结晶变化进行了分析，并比较了其对小鼠胚胎的冷冻效果。结果表明，－5.0℃植冰时，100mL／L 乙二醇（PBS＋EG，PEF）、100mL／L 甘 油 （PBS＋GL，PGF）和 50 mL／L乙二醇＋50mL／L甘油（PBS＋EG＋GL，PEGF）3种冷冻液只有部分结晶；当植冰温度为－5.5℃时，PEF和PEGF完全结晶时间为10 min，PGF在15min尚未完全结晶；－6.0℃植冰时，3种冷冻液完全结晶时间分别为8、10和10 min；－6.5℃植冰时，3种冷冻液完全结晶时间分别为5、8和5min。将小鼠胚胎载入上述3种冷冻液，－5.5℃植冰冷冻，待解冻后进行试验发现，囊胚孵化发育率分别为81.7%、68.5%和87.5%；－6.0℃植冰时囊胚孵化发育率分别为80.0%、76.5%和90.9%；－6.5℃植冰时囊胚孵化发育率分别为10.0%、13.3%和38.4%。

4 冷冻和解冻的速度

冷冻和解冻的速度对受精卵的生存性有很大的影响，而且两者的搭配也很重要。Bilton等①在冷冻羊的受精卵时，以0.15℃／min的速度冷冻、2.2℃／min的速度解冻，结果比以1.2℃／min的速度解冻的生存率高；以0.3℃／min的速度冷冻、4.6℃／min的速度解冻，结果比以2.2℃／min的速度解冻的生存率高，如表1所示。表明要缓慢冷冻也要缓慢解冻。

据报道，在冷冻过程中改变降温速度，会获得较高的生存率。不同种类的动物和处于不同发育阶段的受精卵，其最适宜的冷冻和解冻速度也不同。绵羊受精卵冷冻保存的降温速度一般是0.1℃／min；解冻时，从液氮中取出后先移入冷却到－80～－50℃的酒精中，以1.2～12.0℃／min的速度升温到－10～0℃，然后直接移到室温或37℃环境中。

5 抗冻剂的去除

将解冻的受精卵放入室温环境中，分数次添加保存液，逐渐稀释抗冻剂；然后，将受精卵在培养液或移植液中清洗数次，以供培养或移植用。张锁链等［4］以乙二醇作为防冻剂对绵羊试管胚进行冷冻保存，解冻后不去除防冻剂移植的效果明显优于去除防冻剂后移植的效果。究其原因，可能是由于直接移植的方法不仅省去了胚胎的体外操作过程、减少了胚胎人为损伤的可能性，而且大大缩短了胚胎在体外暴露的时间，使胚胎遭受污染的可能性明显减小。

6 受精卵的发育程度

由表2可以看出，绵羊受精卵的发育程度是影响受精卵冷冻保存的重要条件。Smorag①将冷冻保存了3d的处于分裂至8或16个细胞阶段的绵羊受精卵解冻后培养，结果无受精卵发育，原因可能是受精卵在降温至0℃的过程中受到了损害。冷冻保存的分裂至8、16或32个细胞的绵羊受精卵，解冻后均发生变性，而只有处于桑椹胚－胚囊时的受精卵解冻后才能确保其形态正常。Willaden等①为获得大量发育程度正常的受精卵，对绵羊进行了超数排卵的处理，并于其交配后的第2天采取受精卵，移植到没有进行激素处理的母羊体内，5d后回收取得处于桑椹胚－胚囊期的受精卵。

表2 不同发育程度的绵羊受精卵的保存效果

［1］王志清，角田幸生.关于哺乳动物卵子生殖免疫学的研究［J］.中国畜牧兽医杂志，1983（2）：11－13.

［2］LEGAL F，BARIL G，VALLET J C，et al.In vivo and in vitro survival of goat embryos after freezing with ethylene glycol or glycerol［J］.Theriogenology，1993，40（4）：771－777.

［3］安志兴，李向臣.不同植冰温度下冷冻液的结晶变化及其对小鼠胚胎冷冻的效果［J］.西北农林科技大学学报，2003（3）：11－14.

［4］张锁链，旭日干，庞也非，等.绵羊体外受精卵冷冻解冻后的移植［J］.畜牧兽医学报，1993（3）：200－203.