高效液相色谱法测定复方鬼臼毒素凝胶中鬼臼毒素的有关物质

冯彩丽 于 泳 蒋立新 张洪山

1.北京舒泰神新药研究有限公司，北京 100176；2.北京赛升药业股份有限公司，北京100176

高纯度的鬼臼毒素治疗生殖器疣疗效显著，且无系统性毒副作用。作为目前治疗尖锐湿疣的一线药物，鬼臼毒素酊剂在临床已应用多年，其治疗作用得到广泛的肯定。酊剂在使用过程中会对皮肤产生较大的刺激性，应用后局部皮肤黏膜糜烂，给患者造成较大的痛苦。为提高患者的依从性，临床使用时会联合局麻药，比如盐酸利多卡因等，以减少鬼臼毒素的刺激性，从而增加患者的依从性。本公司通过摸索应用现代制剂技术将鬼臼毒素和盐酸利多卡因两个药物进行组合研制出复方鬼臼毒素凝胶剂，该剂型比现有的酊剂、膏剂、激光治疗有明显应用优势，大大提高了患者的依从性。以往文献中均报道鬼臼毒素的各种含量测定方法，但无有关物质方面的研究，实际鬼臼毒素受pH影响，易被氧化，本制剂中除含有凝胶剂的常用辅料，还含有盐酸利多卡因局麻药，为考察本复方中鬼臼毒素是否稳定，并且不受盐酸利多卡因的干扰，笔者通过摸索建立了鬼臼毒素的有关物质测定方法，从而更好地评价含鬼臼毒素的各种制剂的质量。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津：型号LC-20AT，LC-solution工作站，SPD-20A检测器，CBM-20A控制器），CX-250 型超声波清洗器（北京市医疗设备二厂）。

复方鬼臼毒素凝胶（北京舒泰神新药研究有限公司，批号：20100111、20100114、20100118），鬼臼毒素原料药（福建华海药业有限公司，批号：091201），盐酸利多卡因原料药（山西新宝源制药有限公司，批号：20070501），鬼臼毒素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111645-200301），甲醇（Burdick&Jackson，色谱纯），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.1.1 色谱柱

Kromasil ODS 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用稀磷酸调 pH 值至 7.5）-甲醇（48∶52）为流动相；检测波长为292 nm；柱温为30℃。理论塔板数按鬼臼毒素峰计算应不少于5 000。

2.1.2 测定方法

取本品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg，盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液即为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液Ⅰ。另取不含鬼臼毒素的凝胶空白辅料同法配制，作为空白辅料溶液。精密量取对照溶液20 μL，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰峰高约为满量程的20%。再精密量取空白辅料溶液及供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4 倍，供试品溶液若显杂质峰，扣除空白辅料溶液色谱峰后，量取各杂质峰的峰面积总和，应不大于对照溶液主峰面积的2 倍。

2.2 方法验证过程

2.2.1 专属性试验研究

为使方法具有很好的专属性，分别进行了如下试验研究：2.2.1.1 复方鬼臼毒素凝胶（不加盐酸利多卡因）样品的破坏试验 凝胶样品（不加盐酸利多卡因）溶液：取本品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为凝胶样品溶液A。分别取凝胶样品溶液A适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取各破坏样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图1 可知，不加盐酸利多卡因的凝胶破坏色谱图中，各色谱峰均在50 min之前出峰，各峰分离度符合要求。

2.2.1.2 复方鬼臼毒素凝胶（不加鬼臼毒素）样品的破坏试验取凝胶（不加鬼臼毒素）样品3 g（约相当于盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液作为凝胶样品溶液B。分别取凝胶样品溶液B适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取各破坏样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图2 可知，不加鬼臼毒素的凝胶破坏色谱图中，扣除溶剂峰后，只在50 min之后出现一个色谱峰，即盐酸利多卡因的色谱峰，由于出峰时间比较长，所以保留时间有波动，但不干扰鬼臼毒素各峰的检验。

2.2.1.3 复方鬼臼毒素凝胶样品的破坏试验 取凝胶样品3 g（约相当于鬼臼毒素15 mg，盐酸利多卡因60 mg），置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，强力振摇，使凝胶溶解，过滤，弃去初滤液，取续滤液即为供试品溶液。分别取供试品溶液适量进行酸、碱、氧、高温、光照的破坏试验，分别取上述溶液样品过滤后，精密量取20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，由图3 可知，50 min之前出现的色谱峰与不加盐酸利多卡因的凝胶破坏色谱图中出现的色谱峰基本一致，即均为鬼臼毒素产生，而在50 min之后出现的色谱峰，均与不加鬼臼毒素的凝胶（只含盐酸利多卡因）破坏色谱图中出现的色谱峰一致，即扣除50 min之后色谱峰后，即为鬼臼毒素产生的色谱峰，不干扰鬼臼毒素各峰的检验。

2.2.2 检测限

取鬼臼毒素对照品适量，精密称定，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）溶解稀释制成浓度为0.061 μg/mL的溶液，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，此时主峰峰高约为基线噪音的3 倍，即检测限（S/N=3）为 0.61 ng。

2.2.3 精密度试验

取鬼臼毒素对照品适量，精密称定，用甲醇-水=40∶60（pH 4.0）溶解稀释制成浓度为0.3 mg/mL的溶液，连续进样6次，主峰峰面积的RSD为0.27%，符合要求。

2.2.4 稳定性试验

取凝胶样品3 g，按“2.1”项下方法，制备供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8 h测定，记录色谱图中鬼臼毒素的杂质峰面积，提示溶液在8 h内稳定。结果见表1。

2.2.5 重复性试验

取凝胶样品，照“2.1”项下测定方法平行配制6份供试品溶液并测定有关物质，结果6份样品的有关物质平均值为0.20%，RSD符合要求。

表1 溶液稳定性试验中峰面积的测定结果（UV法）

2.3 三批样品有关物质测定

取复方鬼臼毒素凝胶样品（批号：20100111、20100114、20100118）及空白辅料适量，精密称定，按“2.1”项下方法测定，三批样品的有关物质分别为0.21%、0.23%、0.25%。

所有检测均在仪器通道A（Channel A）下进行。

3 讨论

3.1 流动相的选择

[1-3]并根据大量预实验液相条件摸索结果可知，在甲醇-0.1 mol/L磷酸氢二钾（pH=7.5）系统中，鬼臼毒素保留时间适中，峰形较好，对该流动相系统进一步考察发现，当甲醇-0.075 mol/L磷酸氢二钾（调pH=7.5）为48∶52 时可获得最优峰形，且杂质与主峰分离良好，因此确定流动相为：磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾17.12 g，置1 000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用稀磷酸调 pH 值至 7.5）－甲醇（48∶52）。在流动相摸索过程中，发现柱温对本品的的鬼臼毒素及盐酸利多卡因保留时间有影响，因此控制本品的柱温为30℃

3.2 溶解样品溶剂的选择

由于鬼臼毒素在pH值高的环境下不稳定，且鬼臼毒素几乎不溶于水，而略溶于甲醇及无水乙醇；盐酸利多卡因易溶于水及无水乙醇。所以应选择pH值低的、并含有一定比例的有机溶剂来溶解鬼臼毒素原料，通过试验可知，在甲醇-水=40∶60（pH=2.0～4.0）的溶剂中，鬼臼毒素稳定，但低 pH值下，损伤色谱柱，因此选择甲醇-水=40∶60（pH=4.0）作为溶剂来溶解鬼臼毒素及盐酸利多卡因原料。

凝胶样品的辅料中含有增溶剂及水溶性高分子物质，并且 pH 值（3.0～5.0）较低。曾采用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶剂来溶解样品，结果过滤困难，所以考虑直接用水稀释样品，具体方法为取凝胶样品3 g，置50 mL量瓶中，加水适量，振摇使凝胶溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液备用。试验结果表明，采用水来溶解样品，易于过滤，并且样品溶液的稳定性符合要求。

3.3 测定波长的选择

称取鬼臼毒素对照品适量，用甲醇-水=40∶60（pH=4.0）的溶剂配制成每毫升约含50 μg的溶液，作为供试品溶液，取供试品溶液适量，照紫外分光光度法在200～400 nm波长范围内扫描。结果显示，鬼臼毒素在292 nm、216 nm波长处有最大吸收。另取原料、辅料及专属性项下破坏的样品，采用液相色谱法分别在220 nm（因216 nm波长太低，基线不平稳）、292 nm下检测，结果显示，在292 nm波长处检出的杂质峰个数及响应值均比220 nm波长处检出的多，但在292 nm波长处检出的辅料峰更少，因此，为减少辅料干扰以及近紫外区易造成的基线漂移和噪声干扰，同时参考国家药品标准WS1-（X-043）-2002Z鬼臼毒素项下有关物质的检测波长为292 nm，因此本品选择292 nm作为有关物质检查的测定波长。

3.4 有关物质研究

图1 不加盐酸利多卡因凝胶样品及破坏的色谱图

图2 不加鬼臼毒素的凝胶样品及各种破坏的色谱图

本品为复方制剂，对复方制剂的有关物质研究的文献报道较少，一般由于主药成分性质的差异，很难采用一个色谱条件将主成分各杂质峰及降解产物峰分开，本实验中曾摸索采用同一个色谱条件分析鬼臼毒素与盐酸利多卡因有关物质，结果或是杂质与主峰的分离度达不到要求，或是两个主峰的杂质峰之间相互干扰，降解产物峰分不开，或是保留时间太长。所以考虑采用两种液相条件分别对鬼臼毒素及盐酸利多卡因进行有关物质考察，本文对鬼臼毒素的有关物质进行了详细研究，从专属性研究结果可知，采用本色谱条件，空白辅料及盐酸利多卡因不干扰鬼臼毒素有关物质的检测，破坏条件下产生的色谱峰均为鬼臼毒素产生的色谱峰，与主峰的分离度符合要求。

图3 凝胶样品及各种破坏的色谱图

综上所述，采用HPLC测定复方鬼臼毒素凝胶中鬼臼毒素的有关物质，专属性好，准确度高，重现性好，可用于本品的质量控制，同时本研究也为复方制剂的有关物质研究提供了一种研究思路。

[参考文献]

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