纳豆溶栓效应的研究

李虹，冯雷，刘毅，宋国勇，陈辉，张露

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

2(北京大学营养与保健食品评价中心，北京，100083)

纳豆溶栓效应的研究

李虹1，冯雷1，刘毅2，宋国勇1，陈辉1，张露1

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

2(北京大学营养与保健食品评价中心，北京，100083)

探讨了纳豆产品的溶栓效应。采用冻干纳豆粉灌胃，在复制的大鼠血栓模型上，通过动态观察血压的变化，比较血栓的大小以及检测纤溶酶原激活物质抑制剂(PAI)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)活性等指标，观察冻干纳豆粉对血栓的作用及其机理。将SD大鼠随机分5组(N=40)，实验组用不同浓度的冻干纳豆灌胃，同等剂量的蚓激酶设为阳性对照，用Powerlab/4s描记股动脉血压，采用酶联免疫吸附法测定血浆中PAI-I及tPA活性。冻干纳豆组与正常对照组、单纯血栓组相比，复制血栓前血压无显著性差异(P＞0.05)，血栓复制40min后，冻干纳豆组、阳性对照组与单纯血栓组血压相比有显著性差异(P＜0.001);冻干纳豆处理的动物与单纯血栓组动物比较，其血栓的湿重、干重显著性降低(P＜0.001);冻干纳豆组、阳性对照组血浆中tPA活性升高，PAI/tPA比值与对照相比显著降低(P＜0.001)。冻干纳豆对动脉血栓的形成有抑制作用。

纳豆，冷冻干燥，纳豆激酶，溶栓效应

血栓的形成是引起心肌梗死、脑卒中等心血管疾病死亡的重要因素之一，控制血栓的形成、增强纤溶活性对心脑血管疾病防治具有重要意义。从膳食成分中发现和开发抗栓和溶栓物质，具有广泛的临床实用价值[1］。流行病学调查发现，日本人心脑血管疾病的发病率明显低于其它民族，这与其传统饮食习惯有关。纳豆(Natto)是在日本备受关注的一类营养食品，它是以大豆为原料，煮熟之后加入纳豆菌(枯草杆菌Bacillus subtilis)发酵制成的一种传统食品。据记载，纳豆起源于中国，公元753年中国唐代高僧鉴真东渡日本传经时，携带了“甜豉”到日本，这种甜豉应该就是纳豆的前身，至今纳豆已经有近2000年的食用历史。纳豆类似于我国的豆豉，其营养价值极高。近年来，人们对它广泛的生物学作用及其保健功能极为重视。已有研究证明，纳豆对心脑血管疾病、骨质疏松、便秘等有预防和治疗效果。1987年Sumi等人发现，纳豆在体内外均具有溶栓作用[2-3］，但抗栓效应机理还未完全阐明。本研究采用冻干纳豆灌胃，在复制血栓的模型上，观察其对血栓形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

正常雄性S-D大鼠40只，体重200～250 g左右，北京大学医学部动物中心提供;冻干纳豆，中国食品发酵工业研究院;蚓激酶，购于北医三院;tPA、PAI试剂盒，购自上海实业医大生物技术有限公司;其它试剂为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠血栓模型制作及实验分组

参照Kurz等[4］方法复制动脉血栓形成模型。大鼠禁食8 h，自由饮水，用20%乌拉坦腹腔注射(5 mL/kg)麻醉，股动脉插管经换能器在生理多导仪上监测股动脉血压。腹正中切口，游离约2 cm长的膈下腹主动脉段，用30%FeCl3浸渍过的滤纸(1 cm×1 cm)仔细包裹腹主动脉(小心保护周围组织)，30 min后取除滤纸条，10 min后结束实验。

实验分组:⑴单纯血栓组:操作见上述;⑵低剂量冻干纳豆组:预先用冻干纳豆30 mg/(kg·次)，灌胃，连续2天，血栓制备同第1组;⑶高剂量冻干纳豆组:方法同第2组，但灌胃纳豆素剂量为300 mg/(kg·次);⑷蚓激酶组:方法同第2组，但用蚓激酶剂量为30 mg/(kg·次);⑸对照组:操作同第1组，但所覆盖腹主动脉的滤纸片为生理盐水浸泡。

1.2.2 监测指标

⑴血液动力学、形态学检测及蛋白定量

观察血压的变化，实验结束时从血栓上端腹主动脉或肾静脉抽血(股动脉放血)3～5 mL，离心后取血清作生化检测。结扎滤纸条覆盖部位上下端动脉(至少距1 cm以上)，从腹主动脉滤纸覆盖部位准确取局部血栓段1 cm，放入盖玻片上称其湿重，然后在烤箱内(90℃过夜)烤干称其干重，并将其溶于2 mL碱性NaHCO3溶液中(在0.1mol/L NaOH溶液中含2%Na2CO3)，沸水浴3min，用考马斯亮蓝法蛋白定量，计算血栓的蛋白含量(mg pro/g DW)。

⑵生化指标检测

PAI-1、tPA(上海实业-医大生物技术有限公司生产)测定:取血2 mL置于含3.8%枸橼酸钠200μL的试管中混匀，2500 r/min离心15min，血浆于-20℃保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，PAI-1的单位以UI/mL表示，tPA的单位以UI/mL表示或用发色底物法测其活性[5］，PAI-1用发色底物法测其活性。按试剂盒说明制备标准曲线，将待测标本稀释后加入平底酶标板，然后按说明加入发色底物、纤溶酶原和加速剂，37℃水浴180 min后终止反应，应用BIO-RAD型酶标仪在405nm波长下测定各孔的OD值，根据标准曲线的回归方程计算PAI-1活性。PAI-1的正常参考值为(5.94±2.47)AU/mL。tPA活性测定用发色底物法，按试剂盒说明制备标准曲线，将待测标本稀释后加入平底酶标板，然后按说明加入发色底物、纤溶酶和加速剂，37℃水浴180 min后终止反应，应用BIO-RAD型酶标仪在405 nm，波长下测定各孔的OD值，根据标准曲线的回归方程计算tPA活性。血浆tPA抗原测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理测定血浆tPA抗原。按试剂盒说明，将tPA标准品准确复溶、倍比稀释，得浓度为60、30、15、7.5、3.75 ng/mL 五个标准点:将不同浓度标准品和待测血浆100μL加入抗体包被酶标板各孔中，37℃孵育150 min后弃去反应空内液体，用洗涤液洗涤3次，拍干，再加入酶标抗体100μL，37℃孵育60 min，洗涤3次后拍干，然后每孔加底物100μL，37℃孵育15～20 min后每孔加终止液50μl，在BIORAD型酶标仪上492 nm处测定各孔的OD值，以OD492对tPA标准品浓度在半对数坐标纸上作标准曲线，待测样品tPA抗原水平(ng/mL)可从标准曲线上查出tPA抗原的正常参考值为1.0～12.8ng/mL。

1.2.3 数据处理

以均值±标准差表示，用one-way ANOVA作统计学处理，组间比较用Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 冻干纳豆对血栓形成的影响

本实验各组血清中tPA、PAI、PGI2、TAX2检测结果及血压、血栓形成情况见表1。

由表1可以看出，与单纯血栓组相比较，治疗各组血栓湿重、血栓干重和血栓蛋白含量均明显降低(P＜0.01)，高剂量冻干纳豆组与蚓激酶组血栓湿重略低于低剂量冻干纳豆组(P＜0.01)，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各实验组血栓湿重、干重、蛋白定量

2.2 冻干纳豆对血压的影响

由表2看出，血栓组动物股动脉血压在血栓复制后较血栓复制前降低60%(P＜0.01)，表明股动脉严重血栓栓塞，药物治疗各组血栓制作后股动脉血压降低幅度较单纯血栓组明显轻微(P＜0.01)，而接近对照组血压水平(P＞0.05)，各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 实验动物在复制前后股动脉血压变化

2.3 冻干纳豆对大鼠血浆中tPA、PAI活性的影响及PAI/tPA比值的变化

由表3可以看出，与对照组相比较，血栓形成(单纯血栓组)既激活 PAI也激活 tPA(P均为0.01)，PAI/tPA显著减少(P＜0.01)，表明内源泉性纤溶系统激活。治疗各组PAI水平明显低于，而tPA水平显著高于单纯血栓组(P均小于0.01)，PAI/tPA的比值亦明显降低(P＜0.01)，高剂量纳豆组略高于低剂量纳豆组(P＜0.01)，与蚓激酶组差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 冻干纳豆对大鼠tPA、PAI的水平的影响

3 实验结论与分析

由试验结果可以看出，冻干纳豆组与正常对照组、单纯血栓组相比、复制血栓前血压无显著性差异，血栓复制40 min后，冻干纳豆组、阳性对照组与单纯血栓组血压相比有显著性差异;冻干纳豆处理的动物与单纯血栓组动物比较，其血栓的湿重、干重显著性降低;冻干纳豆组、阳性对照组血浆中tPA活性升高，PAI/tPA比值与对照相比显著降低。

tPA为体内重要的纤溶激活剂。在血栓形成的过程中，有大量的纤溶酶原(plasminogen，PLG)被吸收入血栓中，形成纤溶酶原/纤维蛋白复合物。tPA主要是由血管内皮细胞合成和释放的丝氨酸蛋白酶，能选择性地作用于纤溶酶原/纤维蛋白复合物，使PLG转变为纤溶酶(plasmin，PL)，PL能将纤维蛋白(fibrin，Fb)裂解成纤维蛋白降解产物，从而溶解血栓。研究结果显示，大鼠经灌胃冻干纳豆粉后，血液中的tPA含量升高，大鼠血栓重量减少，说明纤溶系统功能加强，可以降解血栓，因此，纳豆冻干粉中含有促进tPA产生的酶-纳豆激酶。体内同时存在着PAI，在所有的PAI中，以PAI-1最为重要。正常情况下血浆tPA和PAI-1处于动态平衡状态[6］。全血 PAI-1的3/4储存在血小板中，当血小板活化释放时，PAI-1被释放到血液中，抑制tPA的活性。血浆PAI-1水平升高与心肌梗死、动脉粥样硬化、血管再狭窄等心脑血管病变的形成关系密切。本研究结果PAI-1/tPA比显著降低，也表明对大鼠血栓的降解有促进作用。因此，冻干纳豆中存在特异性的酶-纳豆激酶对动脉血栓的形成有抑制作用。

[1]陈志文，徐尔尼，肖美燕.纳豆激酶的研究进展[J］.食品科技，2002(2):66-68.

[2]Simi H，Hamada H，Tsushima H ，et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto，a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J］.Experientia，1987，43:1110-1111.

[3]渡边杉夫，《纳豆》[M］.日本:农山渔村文化协会，2002:14-15.

[4]Kurz KD，Main BW，Sandusky GE，et al.Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride[J］.Throm Res，1990，60:269-280.

[5］ 李家增.血液实验学[M］.上海:上海科学技术出版社，1997:289-290.

[6］ 阮长耿.血栓与止血现代理论和临床实践[M］.南京:江苏科学技术出版社，1994:133-166.

ABSTRACTThis Paper evaluates the thrombolytic effect of freeze-dried Natto products(referred to as:freeze-dried natto)by dynamic measuring the change of blood pressure，the size of thrombus and the activity of plasminogen activator inhibitor substances(PAI)or tissue plasminogen activator(tPA)in the thrombus mode.S-D rats were divided into five groups randomly(N=40)，fed with different concentrations of freeze-dried natto or the same dose of Lumbrokinase respectively.The femoral artery pressures were traced by Powerlab/4s.The PAI and tPA activity were detected by ELISA.The femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto，fed with Lumbrokinase and fed with normal chow were all at the same level(P ＞0.05).The decrease level of femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase were lower than the rats fed with normal chow since after the thrombus forming for 40 min(P ＜0.001).The wet weight or dry weight of the thrombus were significantly lower on the rats fed with freezedried natto than that on the rats fed with normal chow(P ＜0.001).Compared with the rats fed with normal chow，the tPA activity increased as well as the PAI/tPA ratio decreased obviously in plasma of the rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase(P ＜0.001).The freeze-dried natto can inhibit the formation of arterial thrombosis.

Key wordsnatto，freeze-dry，nattokinase，thrombolytic effect

The Study on Thrombolytic Effect of Nattokinase

Li Hong1，Feng Lei1，Song Guo-yong1，Chen Hui1，Zhang Lu1，Liu Yi2
1(China National Research Institute of Food and Fermentation，Beijing 100027，China)
2(Nutrition and Health Food Evaluation Center of Peking University，Beijing 100083，China)

学士，高级工程师。

2012-02-16，改回日期:2012-03-06