酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达*

王彩澜，刘新育，李学琴，刘亮伟，陈红歌

(河南农业大学生命科学学院农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州，450002)

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达*

王彩澜，刘新育，李学琴，刘亮伟，陈红歌

(河南农业大学生命科学学院农业部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州，450002)

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类，为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达，将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达，成功的构建了表达菌株pHT43－amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG，诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL，又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较s少，因此具有明显的生产优势。

酸性α-淀粉酶基因，高效表达，枯草芽孢杆菌

α-淀粉酶(1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC 3.2.1.1)能够以淀粉为底物，从淀粉内部水解1，4-α-D-葡萄糖苷键，α-淀粉酶在淀粉加工以及味精、氨基酸、抗生素、乙醇等以淀粉为原料的发酵产品生产中具有重要的用途。酸性α-淀粉酶是指在较低 pH条件下(pH 4.0～5.0)仍能保持高酶活性的α-淀粉酶，作为一种极端环境淀粉酶在淀粉加工中显示出更大的应用价值。

目前，酸性α-淀粉酶尚没有工业产品，对酸性α-淀粉酶的研究多集中在产酶菌株筛选、异源高效表达等方面。枯草杆菌是发酵工业中的常用菌种，对人畜安全，是美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部均批准使用的安全菌株。更为重要的是，外源基因在枯草芽孢杆菌中是分泌性表达，产物便于提取和纯化，这是大肠杆菌表达系统不可比拟的，因此枯草芽孢杆菌是极具潜力的基因工程宿主菌［1－2］。目前已有来自侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4基因［3］﹑甘露聚糖酶基因 Man23［4］、耐高温 α-淀粉酶基因［5］等在枯草芽孢杆菌中得以高效表达。

本课题组先期已得到1株产酸性α-淀粉酶菌株——解淀粉芽孢杆菌B-5，其最适pH值为5.0，并克隆 该 酸 性 α-淀 粉 酶 基 因，NCBI登 录 号GU318401［6］。为获得该酸性α-淀粉酶基因的异源高效表达工程菌，本实验室构建了该基因在枯草芽孢杆菌中的重组表达载体，经转化后，通过对工程菌株诱导表达条件的优化，以期获得高活力酸性α-淀粉酶菌株，为酸性α-淀粉酶的实际应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株

JM109，枯草芽孢杆菌WB600和pHT43质粒载体均为本实验室保存，pMD－19T－simple来自TaKa-Ra。

1.1.2 酶和试剂

限制性内切酶BamHⅠ、SmaⅠ，ExTaq酶，Premix EX Taq Version2.0，Rnase，T4 DNA Ligase，氨苄青霉素 Amp，氯霉素 Cm，IPTG，DL2000 DNA Marker，λHindⅢ DNA Marker，蛋白质分子量标准(低)，DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit 2.0)等为 TaKaRa公司产品。

1.1.3 培养基

枯草芽孢杆菌和大肠杆菌所用的培养基均为LB培养基。在需要的时候分别加入100 μg/mL的氨苄和10 μg/mL的氯霉素，10 μg/mL的氯霉素用于重组枯草杆菌的筛选。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA的快速提取

按照参考文献［7］进行。

1.2.2 感受态细胞的制备和转化

按照参考文献［8－9］进行。

1.2.3 表达载体的构建设计

设计一对引物P1(5’－CGCGGATCCGAAACTGCAAACAAATC －3’)和 P2(5’－TCCCCCGGGTTAATGCGGAAGAT－3’)，引物P1和P2中分别引入酶切位点BamHⅠ和SmaⅠ，见下划线。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以实验室保存的pET21a－amy质粒为模板扩增出去信号肽的amy基因。PCR扩增出来的片段纯化回收之后进行双酶切，与同样进行双酶切的pHT43在4℃进行酶连。构建出重组表达载体pHT43－amy。重组载体转入大肠杆菌JM109感受态细胞，在含有100 μg/mL的AMP的平板上进行筛选。从JM109转化子中提取质粒进行重组质粒的鉴定。

1.2.4 表达菌株pHT43－amy/WB600的构建

将重组质粒pHT43-amy转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，在10 μg/mL的氯霉素的LB平板上筛选转化子。将这些转化子挑到加有氯霉素的液体LB培养基中，37℃，220 r/min过夜培养，然后37℃，200 r/min诱导，测酸性α-淀粉酶活力，并进行SDS-PAGE检测外源蛋白。

1.2.5 酸性α-淀粉酶表达条件的优化

将阳性转化子培养14 h，之后加入1 mmol/L IPTG 进行分时段诱导(0、1、2、3、4、5、6、7、8 h)，通过酸性α-淀粉酶活力测定和外源蛋白表达量确定最佳诱导时刻。采用同样的分析方法优化IPTG的使用浓度和诱导时的最佳菌体浓度。

将100 mL的发酵液在5 000 g×5 min条件下离心，上清酶液保存，菌体沉淀用pH 5.0的柠檬酸－磷酸缓冲液洗涤2次，之后加入5 mL柠檬酸－磷酸缓冲液，采用200 W、10 min(工作10 s、间歇30 s、60 次)超声波破碎菌体，离心之后取上清，并定容至100 mL。

1.2.7 酸性α-淀粉酶活力测定

取10 mL的底物溶液放入1个试管，55℃水浴保温10 min后加入粗酶液1 mL，混匀，精确保温10 min，吸取0.5 mL混合液，加入盛有10 mL 0.1 mol/L的HCl的试管中，然后再取该混合液0.5 mL，加入盛有10 mL的碘液试管中摇匀，用分光光度计于660 nm下测定吸光值。对照管用同样的方法测得，只是将粗酶液事先于沸水中10 min后再加入，以蒸馏水作为比色的参比。

酶活力单位:在上述条件下，反应10 min使1%淀粉溶液显蓝强度减低1%所需酶量为1个酶活力单位(U)［10］。

2 结果与分析

2.1 表达载体pHT43－amy的构建

将PCR扩增出来的带有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的去信号肽的amy基因进行双酶切，与同样经双酶切的pHT43质粒在4℃进行酶连，转化大肠杆菌JM109后，提取质粒，经PCR验证(如图1a)、双酶切验证(如图1b)，证明amy基因已经重组至pHT43载体上，将该重组质粒记作pHT43－amy。

吸附等温线：准确称取已预处理树脂5.0 g于锥形瓶中，加入不同浓度的花色苷溶液各50 mL，置于振荡器30 ℃、100 r/min上下振荡3 h，待吸附平衡后测定溶液的平衡质量浓度，并计算吸附量，以吸附量对浓度作图，绘制吸附等温曲线。

图1 重组质粒的PCR验证及双酶切验证

2.2 枯草杆菌重组菌株的构建

在实验中我们选取枯草芽孢杆菌WB600为受体菌，它是6种蛋白酶基因缺陷型菌株，能将重组蛋白分泌到胞外，便于分离提纯，没有密码子偏爱性［11］。将重组质粒pHT43－amy转入感受态细胞WB600中，挑取其中10个阳性转化子进行酸性α-淀粉酶活力检测，结果显示其中1个转化子是假阳性，而其它9个转化子具有相同的酸性α-淀粉酶活力水平，约为1 200 U/mL。选取4号转化子作为后续试验的研究材料。对4号菌株进行SDS-PAGE检测，如图2所示，可知在约66 ku处出现预期大小的酸性α-淀粉酶基因的表达蛋白，通过Quantity One软件分析可知，该外源蛋白可占重组枯草杆菌胞外蛋白的80% 以上。

图2 重组菌株pHT43－amy/WB600粗酶液的SDS-PAGE

2.3 重组枯草杆菌酸性α-淀粉酶表达条件的优化

2.3.1 诱导时间对酸性α-淀粉酶表达量的影响

将重组枯草杆菌培养至OD600为1.0时，加入终浓度为1 mmo/L的IPTG进行诱导，经不同诱导时间的培养后，取出培养液，离心获得粗酶液进行酸性α-淀粉酶活力测定(图3)和SDS-PAGE检测(图4)。可以看出，在诱导6 h时酸性α-淀粉酶活力已达最高，继续诱导至8 h，酶活力没有增加，SDS-PAGE也显示在诱导6～8 h之间外源蛋白表达量没有明显差异，因此后续试验采用6 h的诱导时间。

图3 诱导时间对重组菌株酸性α-淀粉酶活力的影响

图4 不同诱导时间对酸性α-淀粉酶表达量的影响

2.3.2 诱导的起始菌浓度对酸性α-淀粉酶表达的影响

分别在菌体浓度 OD600为 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4时加入1 mmol/L的IPTG诱导6 h后，比较其酸性α-淀粉酶活力，结果如图5所示。可知在OD600为0.8时诱导产生的酸性α-淀粉酶活力最高，进行 SDSPAGE检测(如图6)，通过Quantity One软件分析可知OD600为0.8时的外源蛋白表达量最大，因此认为该重组菌在OD600为0.8时开始诱导最佳。

2.3.3 IPTG浓度对酸性α-淀粉酶表达的影响

将重组枯草杆菌培养至 OD600为0.8，分别加入0.5～1.6 mmol/L(间隔0.1 mmol/L)不同浓度的IPTG，培养6 h后，检测不同IPTG浓度对酸性α-淀粉酶活力和表达量的差异，结果如图7、图8所示。尽管酸性α-淀粉酶活力测定显示IPTG浓度为0.9 mmol/L时活力最高，但SDS-PAGE显示不同浓度IPTG诱导下外源蛋白表达量差异并不明显，说明IPTG浓度对酸性α-淀粉酶的表达没有显著影响，出于经济投入节省成本考虑，后续试验可选择0.5 mmol/L的IPTG浓度进行该酸性α-淀粉酶的诱导表达。

图5 不同菌体浓度诱导时酸性α-淀粉酶活力的变化

图6 不同菌体浓度诱导对酸性α-淀粉酶表达量的影响

图7 不同IPTG浓度对酸性α-淀粉酶活力的影响

2.4 外源酸性α-淀粉酶的分泌情况

为了探究酸性α-淀粉酶在重组枯草杆菌中的分泌情况，用250 mL的三角瓶诱导培养了100 mL菌液，先离心获得胞外酶组分，又将菌体沉淀用pH 5.0的柠檬酸－磷酸缓冲液洗涤2次之后，加入5 mL缓冲液进行超声波破碎，取上清定容至100 mL，此为胞内酶组分。分别测定以上2组分的酸性α-淀粉酶活力，结果如表1所示。可知重组枯草杆菌所表达的酸性α-淀粉酶有98%以上都分泌到了胞外。

图8 不同IPTG浓度对酸性α-淀粉酶表达量的影响

表1 酸性α-淀粉酶的分泌情况

3 结论与讨论

本研究成功地将解淀粉芽孢杆菌酸性α-淀粉酶基因amy在枯草芽孢杆菌WB600中表达，通过对重组菌株表达条件的优化，当菌体浓度OD600达到0.8时，用0.9 mmol/L IPTG诱导6 h，酸性α-淀粉酶酶活力高达1 230 U/mL，是原始菌株α-淀粉酶酶活力360 U/mL的3倍，显示出更大的工业应用潜力。

本实验得到的重组枯草芽孢杆菌表达的酸性α-淀粉酶98%以上都分泌到了胞外;同时，从胞外总蛋白的表达情况来看，杂蛋白较少，外源α-淀粉酶量可占胞外总蛋白量的80%以上，从而使目的蛋白易于被纯化。试验还发现该重组菌粗酶液可在4℃下存放3个月而酶活力没有下降，证明该酶液组分不易被降解，具有良好的稳定性，这些特性都极有利于酸性α-淀粉酶的工业化生产。

［1］ Liu G，Xing M，Yu S W.High-effective expression of thermostableα-amylase from a bacterial phage based recombinant Bacillus subtilis［J］.Chin J Appl Environ Biol，2005，11(3):368 －372.

［2］ Zhang X Z，Yan X，Cui Z L，et al.Recombinant expression and secretion of mpd gene using the promoters of ytkA and ywoF gene from Bacillus subtilis［J］.Chin J Biotechnol，2006，22(2):249 －256.

［3］ 郭菁，田宝玉，蔡婉玲，等.侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达［J］.福建农林大学学报:自然科学版，2011，40(2):165－171.

［4］ 胡杨，周海燕，董蕾，等.甘露聚糖酶基因Man23在芽孢杆菌WB600中的表达［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2007，33(5):539 －541.

［5］ 董晨，曹娟，张迹，等.耐高温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达［J］.应用与环境生物学报，2008，14(4):534－538.

［6］ 安弋.酸性α淀粉酶基因的克隆与表达［D］.郑州:河南农业大学，2010.

［7］ 洪青，张忠辉，张晓舟，等.中度嗜盐菌Halomonas SP.BYS-1启动子的克隆和测序［J］.应用与环境生物学报，2005，(6):729 －732.

［8］ Sambronk J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual［M］.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002:568 －595 .

［9］ Anagnostopoulus C，Spizizen J.Requirements for transformation in Bacillus subtis［J］.J Bacteriot，1961，84:741 －746.

［10］ 谢慧玲，阮森林，刘亮伟，等.酸性生淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究［J］.食品工业科技，2008，10(29):85－87.

［11］ Liu Yi-han，Lu Fu-ping，Li Yu，et al .Characterisation of mutagenised acid-resistant alpha-amylase expressed in Bacillus subtilis WB600 ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78:85 －94.

High-level Expression of Acid-stable α-amylase Gene of Bacillus amyloliquefaciens in Bacillus subtilis WB600

Wang Cai-lan，Liu Yu-xin，Li Xue-qin，Liu Liang-wei，Chen Hong-ge
(Key Laboratory of Enzyme Engineering of Agricultural Microbiology，Ministry of Agriculture，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Acid-stable α-amylase is widely used in fermentation industry.In order to highly express acid-stable α-amylase gene，a recombinant vector containing no signal peptide of acid-stable α-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens was constructed followed by transformation into Bacillus subtilis WB600host.The highest activity of recombinant acid-stable α-amylase was 1230 U/mL under the condition as follows:OD600 of the initial bacteria was 0.8 and final concentration of IPTG was 0.9 mmol/L，and the cell suspension was cultured for 6 hours after addition of IPTG.As the recombinant Bacillus subtilis WB600 secreted few other proteins except the targeted acid-stableα-amylase，it showed obvious advantages in amylase production.

acid-stable α-amylase gene，high level expression，Bacillus subtilis

硕士研究生(陈红歌教授为通讯作者)

*河南省教育厅自然科学研究计划(2010A180006)

2011－12－13，改回日期:2012－03－31