浓香型白酒酒醅真菌群落结构及其变化规律*

侯海波，罗惠波，黄治国，叶光斌

(四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡，643000)

浓香型白酒酒醅真菌群落结构及其变化规律*

侯海波，罗惠波，黄治国，叶光斌

(四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡，643000)

利用PCR-DGGE技术研究了浓香型白酒酒醅真菌群落结构及其发酵过程中的变化规律，结果发现，所有酒醅样品均出现9～19条较清晰的条带，其中第2、5、8、9、14、17号条带在所有样品中均有检出，且优势度较高;所有样品生物多样性指数都在1.68～2.61之间。发酵前期，多样性指数呈先下降后上升的趋势，发酵至第21～49天基本保持平稳，第56天时，多样性指数到达最低值，第63天回升之后多样性指数持续下降，发酵至第84天时略有回升;不同发酵时期酒醅真菌DGGE图谱相似性指数较低，表明不同发酵时间酒醅样品真菌群落间差异较大。

白酒酒醅，真菌，PCR-DGGE，18S rDNA，微生物群落

浓香型白酒的生产过程与微生物菌群的演化交替密不可分，窖池微生物经过长期的驯化和发展，慢慢形成了独特的微生物群落。酒醅富含丰富的微生物，除了细菌，古菌等原核微生物外，还有真核微生物，这些微生物的代谢产物是浓香型白酒酒体风味与口感形成的重要物质基础[1］。因此，探讨发酵过程中浓香型白酒酒醅微生物群落特性的差异及其变化规律，对浓香型白酒生产有着重要的指导意义。

前人采用平板培养，从酒醅中已分离出酵母属、霉菌属等真菌类群[2］。但是以形态学和生理生化指标为基础的真菌检测和分类方法较为复杂，而且所得出的结论难免与实际情况有所偏差。近些年来分子生物学的方法越来越多地应用于微生物群落的研究，有学者利用基因克隆研究酒醅真菌群落的多样性[3］，也有学者利用PCR-SSCP探讨浓香型大曲真核微生物群落的多样性[4］，以及利用PCR-DGGE分析油脂废水处理系统中酵母菌群落结构等[5］，这些技术在真菌多样性的研究中取得了可观的成果。

本试验利用PCR-DGGE技术，研究发酵过程中酒醅真菌群落结构及其变化规律，为中国白酒生产研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

酒醅样品采自四川旭水酒业有限公司生产窖池中上位置(距窖壁1m，距窖顶0.5m)，迅速置于冰盒运回实验室，-20℃保藏。

1.1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶，大连宝生物工程有限公司;去离子甲酰胺，德国AppliChem。

1.1.3 主要仪器

PCR仪，美国 BIO-RAD公司My cycle;DGGE电泳仪，美国 BIORAD公司，Dcode;高速冷冻离心机，德国Hettich公司，UNIVERSAL 32R;凝胶成像系统，美国 SIM公司，Bio-Best200E。

1.2 方法

1.2.1 酒醅微生物总DNA提取

用SDS-酚氯仿抽提法[6］提取酒醅微生物基因组DNA，然后用核酸蛋白仪检测DNA的浓度和纯度，保存于-20℃备用。

1.2.2 引物设计与合成

采用真菌通用引物 nu-SSU-0817-5’:5＇-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3＇和 nu-SSU-1196-3’-GC:5＇CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGTCTGGACCTGGTGAAGTTTCC-3＇。扩增18S rDNA 的 V6-V8 区[7］，引物由上海英俊生物技术公司合成。

PCR 反应体系为50 μL:1.0μL Taq酶(5U/μL)，5.0 μL 10× buffer，3.0 μL MgC12(25 mmol/L)，4.0 μL dNTPs Mixture(各 2.5 mmol/L)，引物(10 μmol/L)各 2.0 μL，2.0 μL 模板 DNA(100 ng/L)，31.0 μL灭菌双蒸水。PCR扩增程序:95℃预变性9 min;PCR循环:95℃1min，48℃1 min，72℃1 min，一共35 个循环;然后72℃延伸10 min。PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染后拍照。

1.2.3 DGGE分析

在50 μL PCR 产物中加入8 μL6×loadding buffer混匀，取20 μL加入40%～55%(100%的变性剂中含有7 mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺)梯度变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为38∶2)的加样孔中，胶的规格为20 cm×20 cm，厚1 mm，在1×TAE电泳液中电泳，电泳温度为60℃，先用200V电泳5 min，然后130 V电泳14h，银染后拍照。

1.2.4 数据分析

研究群落多样性的方法很多，本研究主要用丰度(S)、优势度、样品间相似性指数(Cs)和shannon-wiener指数(H)来表示。通过quantity one软件对DGGE图谱进行分析。具体过程如下:

(1)丰度(S):用DGGE图谱中条带的个数表示。

(2)优势度:用某一特定条带的峰面积占样品总体峰面积的百分数来表示。

(3)Shannon-Wiener多样性指数[8］:反映群落种类与均匀度的混合参数，即种类数目多，可增加多样性;同样，种类之间个体分配的均匀性增加也会使多样性提高。

式中，H为Shannon-Wiener多样性指标值;pi为第i个物种所占的百分比，即是第i种的个体数与个体总数的比例;S为样品中含有多少种不同的物种的数量，即该样品总DGGE条带数。

⑷相似性用索伦森配对相似性系数(Sorenson Pairwise Similarity Coefficient)[9］来计算:

式中，Cs为索伦森配对相似性系数;a为某一样品的PCR-DGGE图谱的条带数目;b为另一样品的PCR-DGGE图谱的条带数目;j为2个泳道所共有条带的数目。

2 试验结果与分析

2.1 酒醅真菌18S rDNA PCR扩增结果

酒醅样品微生物总DNA光吸收比值OD260/OD280均在1.70～1.90之间。用引物nu-SSU-0817和nu-SSU-1196-GC扩增酒醅真菌18S rDNA，得到460bp左右的片段(图1)，符合引物设计的片段。

2.2 酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE图谱

从酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE图谱(图2)中可以看出，所有样品均出现9～19条较清晰的条带，说明各样品18S rDNA PCR产物通过DGGE得到了较好的分离。

图1 酒醅细菌18S rDNA PCR扩增结果

图2 酒醅真菌群落DGGE图谱

2.3 酒醅真菌DGGE图谱丰度变化规律

本试验分析了DGGE图谱中真菌丰度的变化规律，结果发现:丰度总体上呈先下降后上升，而后保持平稳，再下降的趋势，后期基本平稳。在发酵第1天时，丰度达到最大值19;在发酵第56天时，丰度值达到较低值，仅为9;到发酵第77，84天时，丰度值基本保持平稳。

2.4 酒醅真菌DGGE图谱条带优势度变化规律

本试验分析了DGGE图谱中主要条带优势度的变化规律(表1、图 3)，结果发现:第 2、5、8、9、14、17号条带在所有样品中均有检出，其中第2、5、8号条带优势度随着发酵时间的增加总体呈先下降后上升再下降并保持平稳的变化趋势，到发酵后期有波动;第2、5、8号条带的优势度分别在发酵第70天，第77天，第84天达到最大值。9、14、17号条带优势度随着发酵时间的增加总体呈先上升后下降，再上升又下降最后上升的变化趋势。第9、17号条带的优势度变化趋势较为相似，分别在发酵第21天，第70天达到最大值。第14号条带的优势度在发酵第35天达到最大值;第3、6号条带所代表的真菌类群，仅在发酵前期样品中有检出。第21、22号条带所代表的真菌类群，只在发酵中后期酒醅样品中有检出。第20号条带所代表的真菌类群，只在发酵中期酒醅样品有检出。

图3 酒醅真菌群落条带优势度变化规律

2.5 酒醅真菌DGGE图谱多样性指数变化规律

本试验分析了DGGE图谱真菌群落多样性指数的变化规律，结果发现:酒醅样品真菌多样性指数都在1.68～2.61(图4)。随着发酵时间的开始，多样性指数略呈先下降趋势，发酵第21天时，多样性指数开始回升，之后保持平稳，发酵第42天时，多样性指数达到最大值2.61。到第49天时，多样性指数开始下降，发酵第56天时，多样性指数达到最小值1.68，第63天回升后又持续下降，到发酵第84天时，多样性指数略有回升。

图4 酒醅真菌群落多样性指数的变化规律

2.6 酒醅真菌DGGE图谱相似性指数

本试验分析了酒醅真菌群指纹图谱的相似性(表2)，结果发现:发酵第21天和第28天的相似性指数为0.69，发酵第35天和第42天相似性指数为0.76，发酵第42天和第49天相似性指数为0.78，其他许多样品间的相似性指数都在0.6以下。基于相似性数据，构建UPGMA聚类图(图5)，结果发现，发酵第35，42，49天聚为一大支，发酵第70，84天聚为一大支。

图5 酒醅真菌群落UPGMA聚类图

表2 不同发酵时期酒醅真菌群落相似性

3 讨论

3.1 酒醅真菌DGGE图谱丰度

生物多样性研究中，丰度代表一定区域的物种数。DGGE将无法检测DNA在基因组中的含量少于1.5%的种群，因此DGGE图谱所反映的是样品中的优势菌群[8］。邢德峰等[10］研究表明，当 DNA 片段为450～500 bp左右片段的，分类信息相对更为丰富。本试验采用真菌通用引物nu-SSU-0817-5’和nu-SSU-1196-3’-GC扩增酒醅真菌18S rDNA，扩增后的DNA片段为460 bp，所得的酒醅样品真菌DGGE图谱的丰度为9～19，实现了酒醅真菌的较好分离。研究结果表明:不同发酵时间样品的条带数差异较大，优势条带在6～8条之间，其中既有所有样品的共有条带，也有部分样品的共有条带，还有个别样品的特异条带;随着发酵时间的增加，样品条带丰度总体上呈先下降，再上升，保持平稳，再下降的趋势，到发酵后期趋于稳定。

3.2 酒醅真菌DGGE图谱条带优势度

条带的优势度反映的是该条带的量在整个样品中所占的比例大小[9］。对具有代表性的优势条带的优势度分析，可在一定程度上代表酒醅细菌群落在发酵过程中演变情况。本试验分析了酒醅真菌DGGE图谱的优势度，结果发现:在所有的酒醅样品DGGE图谱中，都检出第 2、5、8、9、14、17 号6条共有条带，且相对于其他条带而言，优势度较高，说明这6条带所代表的真菌类群，可能在窖池微生态系统中起重要的作用。其中第2、5、8号条带的优势度变化趋势在发酵前中期非常相似，后期都有波动;第9、17号条带优势度的变化趋势在发酵全过程中都较为相似。

3.3 酒醅真菌群落多样性

生物多样性是生态系统稳定性的基础，较高水平的生物多样性有利于生态系统功能的发挥[11］。本试验研究发现:酒醅真菌DGGE图谱的H值为1.68～2.61。发酵前期，随着发酵时间的增加，真菌多样性指数呈先递减后上升的趋势。这可能是由于在发酵过程中，发酵产生的乙醇以及酸类物质会在一定程度上影响真菌群落多样性，多样性指数在发酵第21～49天基本保持平稳，在发酵第56天达到最小值，第63天略有回升后又持续下降，发酵后期厌氧环境的加剧以及营养关系的多样化，都会在一定程度上影响到酒醅真菌群落的多样性。第84天有所回升，这可能是由于发酵后期环境微生物迁移进入酒醅中，使得酒醅微生物多样性指数有所升高。

3.4 酒醅真菌群落相似性

相似性指数主要反映各样品条带数量之间的相似性关系，它是一个最基本的多样性分析指数。王娜等[12］利用DGGE技术分析扇贝养殖海区真核浮游生物种群多样性，发现月份相近的样品中浮游生物微生物群落的相似性较好。施思等[13］利用PCR-DGGE技术分析盛夏习酒酒醅的微生物菌群结构群落的相似性，发现入窖酒醅上下层及出窖酒醅上下层相似系数较高，菌群结构差异不大，而入窖与出窖酒醅的相似系数较低，说明入窖与出窖酒醅菌群结构已存在较大差异。本试验对微生物群落相似性进行分析，发现窖池中上位置酒醅发酵过程中真菌群落间的相似性系数多数较低，在0.6以下，这表明在发酵过程中，不同发酵时间酒醅样品真菌群落间存在一定的差异。

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ABSTRACTThe variational regularity of fungi community in fermentation process of fermented grains of luzhou-flavor liquor were analyzed by PCR-DGGE technique in the test.The results showed that 9～19 clear bands were shown clearly in these grains samples，wherein No.2，5，8，9，14，17 bands were significantly detected in all samples.The diversity index of these samples ranged from 1.68 to 2.61.At the early stage of fermentation，the diversity index of samples generally decreased at first and then followed by increasing.The diversity index was stable from Day 21 to Day 49 and reached the lowest value on Day 56.It increased at Day 63 and then decreased.It slightly rose on Day 84.The similarity indexes of PCR-DGGE patterns of samples from different stages were low，which indicated that the fungi community of Fermented Grains at different fermentation stage had some difference.

Key wordsliquor fermented grains，fungi，PCR-DGGE，18S rDNA，microflora

Fungi Community Structure and Variational Regularity of Fermented Grains of Luzhou-flavor Liquor

Hou Hai-bo，Luo Hui-bo，Huang Zhi-guo，Ye Guang-bin
(Liquor-making Biotechnology＆ Application Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science＆ Engineering，Zigong 643000，China)

在读硕士研究生(罗惠波教授为通讯作者)。

*四川省科技厅应用基础项目(No.07JY029-026);四川理工学院引进人才项目(No.2007-18)

2011-11-25，改回日期:2012-03-21