酸酶水解-HPLC法检测香菇多糖中β-D-葡聚糖含量*

于雅娟，戴军，朱松，陈尚卫，江波

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

酸酶水解-HPLC法检测香菇多糖中β-D-葡聚糖含量*

于雅娟，戴军，朱松，陈尚卫，江波

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

为了更有效地监控食品和医药行业中香菇多糖制品的质量，建立了一种香菇多糖中主要活性成分β-D-葡聚糖含量测定的新方法:香菇多糖样品经酸部分水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶进一步完全水解以测定总葡聚糖含量;另用淀粉葡萄糖苷酶水解样品中α-葡聚糖;根据HPLC测定的总葡聚糖与α-葡聚糖含量之差计得β-D-葡聚糖含量。分别用该方法和苯酚硫酸法及刚果红法测定已知含量的β-D-葡聚糖对照样品的结果表明:该方法最接近于对照品标示值，且重复性好，可用作为香菇多糖产品中β-D-葡聚糖含量测定的专属方法。

香菇多糖，β-D-葡聚糖，酸酶水解，HPLC

香菇多糖是一种以β-(1，3)-D葡萄糖残基为主链，侧链为β-(1，6)-D葡萄糖残基的葡聚糖，其中每5个β-(1，3)-D-Glc就有2个β-(1，6)-D-Glc。香菇多糖的免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等功能和几乎无毒副作用的优点已得到学术界的公认，并已经作为一种辅助治疗肿瘤的药物应用于临床，或作为免疫增强剂用于保健食品中。药理研究结果表明，香菇多糖的主要抗癌活性成分是β-D-葡聚糖[1-2］，其含量的高低是表征香菇多糖产品质量的主要指标之一。然而目前食品或药品企业使用的香菇多糖产品检测方法是蒽酮比色法或苯酚硫酸法(NY/T 1676—2008，食用菌中粗多糖含量的测定，农业行业标准)，主要检测总多糖含量，没有专属性。关于香菇多糖中的β-D-葡聚糖的检测方法尚无文献报道。针对啤酒中β-D-葡聚糖的含量测定，文献中大多采用刚果红法[3］。

本文根据香菇多糖产品的组成特点，建立了一种香菇多糖产品中β-D-葡聚糖含量测定的新方法，即将香菇多糖部分酸水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶进一步完全水解用于测定香菇多糖中的总葡聚糖含量，用淀粉葡糖苷酶水解香菇多糖中的α-葡聚糖，根据HPLC测定的总葡聚糖含量与α-葡聚糖含量之差，计得β-D-葡聚糖含量;并以已知含量的β-D-葡聚糖对照品为样品，分别用本方法和苯酚硫酸法及刚果红法进行检测和比较，以验证3种方法的适用性。

1 实验材料与试剂

1.1 仪器与试剂

Waters 600高效液相色谱仪，配2410示差折光检测器;7200型分光光度计(美国UNICO尤尼柯限公司);D-葡萄糖(Glc，99%，国药集团化学试剂有限公司);酵母β-葡聚糖对照品(纯度53%，美国Sigma-Aldrich公司);昆布多糖对照品(纯度30%，美国Sigma-Aldrich公司);热凝胶多糖(Curdlan，纯度99%，美国Sigma-Aldrich公司);β-(1，3)-葡聚糖外切酶(E.C.3.2.1.58，100000 U/L)，购于上海中西远大科技有限公司;β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21，20，000 U/L)购于上海佳和生物科技有限公司;淀粉葡糖苷酶(EC 3.2.1.3，1，630，000 U/L)，购于南昌瑞洋科技发展有限公司。苯酚、硫酸、刚果红等其他试剂均为分析纯。

葡萄糖标准溶液:准确称取2 g(精确至0.0001 g)经过干燥至恒重的D-葡萄糖，用超纯水定容于100 mL容量瓶中，配制成20 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

6%苯酚溶液:取苯酚100 g，铝片0.01 g和NaHCO30.05 g，蒸馏，收集182℃馏分。称取上述处理过的苯酚5 g，加蒸馏水定容至100 mL。

刚果红溶液:取25 mg刚果红，加入0.2 mol/L pH 8.0磷酸盐缓冲液，定容至250 mL。

1.2 色谱条件

色谱柱:Spherisorb NH2色谱柱(0.46 cm×25 cm，7μm);流动相:乙腈/水(7/3，体积比);流速:1 mL/min;检测器:示差折光检测器。

2 实验方法

2.1 酸酶法

2.1.1 葡聚糖完全水解

分别准确称取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、热凝胶多糖、昆布多糖3个β-D-葡聚糖对照样品至具塞试管中，加入1.5 mL浓HCl(37%，v/v)，混匀。在30℃下水浴45 min。水浴期间每隔15 min涡旋混匀1次，以确保所有的β-葡聚糖溶解。稀释HCl至1.3 mol/L，涡旋混匀，置于沸水浴中，反应2 h。反应完后将试管冷却至室温，加入2 mol/L KOH，直至pH 5.0。定量转移管中的内容物至100 mL容量瓶，用200 mmol/L pH 5.0醋酸钠缓冲液漂洗试管，并合并于容量瓶中，再定容、过滤。取0.1 mL滤液，加0.1 mL用200 mmol/L pH 5.0醋酸钠缓冲液稀释的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，旋涡混匀，40℃反应1 h，得到酶解液1。

2.1.2 酶解 α-葡聚糖

分别准确称取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、热凝胶多糖、昆布多糖3个β-D-葡聚糖对照样品至具塞试管中，加入2 mL2mol/L的KOH，再将试管在冰浴状态下磁力搅拌20 min。向试管中加8 mL的1.2 mol/L pH 3.8醋酸钠缓冲液，磁力搅拌以混匀溶液。立即加入0.2 mL溶于50%甘油的淀粉葡糖苷酶液，混匀，40℃下反应30 min，期间间歇漩涡混匀。离心(1500 g)10 min，得到酶解液2。

2.1.3 HPLC测定酶解液中葡萄糖含量

将葡萄糖标准溶液及上述酶解液分别过0.22 μm的滤膜，按1.2进样分析，以外标法测定葡萄糖含量，并按下列公式计算β-D-葡聚糖含量:

式中X1和X2分别为由酶解液1和酶解液2测得的葡萄糖含量。

2.2 苯酚硫酸法[4］

取葡萄糖标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL到10 mL具塞试管中，分别补水至1.0 mL，混合均匀，加入6%苯酚溶液1.0 mL，混匀，然后迅速垂直滴加5.0 mL H2SO4，立即漩涡混匀。在80℃下反应30 min，静置冷却至室温，于A490nm处测定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)对吸光值A作线性回归，得标准曲线方程。

分别准确称取适量香菇多糖样品及3个β-D-葡聚糖对照品，控制糖含量在10～100 μg内，同标准曲线测定法处理，测其吸光值，并由标准曲线方程计得样品中葡萄糖含量，再计算样品中总多糖含量:

式中，C为样品溶液中葡萄糖的浓度(mg/mL);D为样品溶液的稀释倍数;W为相应的样品质量(mg)。

2.3 刚果红法[3］

2.3.1 标准曲线

由于没有香菇多糖标准品，所以选用与香菇多糖结构类似的curdlan[5］作为标准品。精密称取10 mg curdlan，用0.5 mol/L NaOH溶解，用0.5 mol/L HCl中和至pH 8～9，再定容至100 mL，即得到0.1 mg/mL标准溶液。分别移取其标准溶液0，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL至10 mL具塞试管中，均补水至2.0 mL，混匀，加入pH 8.0的刚果红溶液4.0 mL，摇匀，然后30℃反应30 min，于550 nm处测定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)对吸光值A作线性回归，即得标准曲线方程。

2.3.2 样品中β-D-葡聚糖含量的测定

分别准确称取一定量香菇多糖样品及β-D-葡聚糖对照样品配制成1 mg/mL水溶液，精密吸取0.5 mL至10 mL具塞试管中，补水至2.0 mL，加入4.0 mL刚果红溶液，混匀，30℃反应30 min，于550 nm处测定其吸光值，并由标准曲线方程计得样品中葡萄糖含量。计算样品中β-D-葡聚糖含量:

式中，C为样品溶液中葡聚糖的浓度(mg/mL);D为样品溶液的稀释倍数;W为相应的样品质量(mg)。

3 结果与讨论

3.1 酸酶水解-HPLC法测定原理

β-(1，3)-葡聚糖外切酶来源于木霉菌，该酶的最适反应温度为40～50℃;最适反应pH在pH 6.0以下[7］。该酶的水解模式是与底物结合后从β-(1，3)-葡聚糖的非还原性末端开始依次切开底物的β-(1，3)-葡萄糖糖苷键，释放单一的葡萄糖。β-葡萄糖苷酶，又称β-D-葡萄糖苷，存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。它能够催化水解结合于非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出D-葡萄糖[8］。淀粉葡糖苷酶，又称为葡糖淀粉酶，能够从1，4-α-D-葡聚糖链的非还原性末端依次催化水解1，4-α-D-葡糖苷键，释放出α-D-葡萄糖。也能迅速水解与1，4-糖苷键邻接的1，6-α-D-糖苷键。

本方法是先将香菇多糖进行部分酸水解，使β-D-葡聚糖降解和非凝胶化且切断与蛋白或其它多糖的键合而溶于水，并使α-葡聚糖完全水解。再用β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶把较难酸解的β-葡聚糖完全水解成葡萄糖，然后通过测定释放的葡萄糖的量计算香菇多糖中的葡聚糖总量。为计算β-D-葡聚糖的含量，需扣除可能含有的少量α-葡聚糖。本方法主要利用淀粉葡糖苷酶将α-葡聚糖水解成葡萄糖，再用HPLC测定之。

3.2 酸酶水解-HPLC法测定结果

用已知含量的昆布多糖，酵母β-葡聚糖对照品以及curdlan作为β-D-葡聚糖对照品，与香菇多糖样品一起进行酸酶法测定，其中香菇多糖样品的酶解液1和酶解液2的HPLC谱图见图1和图2，其中保留时间6.32 min是葡萄糖峰。根据外标法计算的结果见表1。由表1可见，该方法测定结果与供试品标示含量很接近。平行样品(n=3)测定结果的相对标准偏差(RSD)为2.02%～2.94%，重复性很好。结果表明，该方法准确可靠，可以用于香菇多糖中β-D-葡聚糖含量的测定。

图1 酶解液1的HPLC谱图

图2 酶解液2的HPLC谱图

表1 酸酶水解-HPLC法测定香菇多糖样品及对照品的β-D-葡聚糖含量(n=3)

3.3 苯酚硫酸法与酸酶法的结果比较

按2.2测得标准曲线的回归方程为y=0.0090x-0.0020，R2=0.9978。在0～100 μg内，糖含量与吸光值线性关系良好。

分别取2.0 mL经稀释好的香菇多糖样品及β-D-葡聚糖对照品，按2.2的方法测定吸光值，平行测定3次，取平均值，通过标准曲线，计算出样品中多糖含量，结果如表2。

表2 苯酚硫酸法及刚果红法测定香菇多糖样品及对照品的葡聚糖含量(n=3)

苯酚硫酸法是多糖含量测定的常用方法，该法测定的是样品中总糖含量，没有选择性，故除Curdlan外结果比酸酶法测定的β-D-葡聚糖含量高许多。其方法缺乏专属性。

3.4 刚果红法与酸酶法的结果比较

刚果红与β-D-葡聚糖的结合具有高度专一性，在一定条件下能够形成有色物质[9］。刚果红法多应用于燕麦和啤酒中的β-葡聚糖的含量测定，所用标准品一般为从小麦中提取出的β-葡聚糖标准品。本文选用与香菇多糖结构类似的Curdlan作为标准品，用与样品溶解相同的方法配制标准溶液，定量测定香菇多糖及β-D-葡聚糖对照品中β-D-葡聚糖的含量。以葡萄糖含量(x)对吸光值(y)作线性回归得标准曲线方程为y=0.0013x+0.0392，R2=0.9960。香菇多糖样品及β-D-葡聚糖对照品的测定结果于表2。与酸酶法比较，测定的结果过低，可能是因为对照品中β-D-葡聚糖分子被其他多糖或蛋白等大分子包裹未能充分溶解和络合，使显色不足，故该法不适用于测定固态供试品中β-D-葡聚糖含量。

4 结论

β-D-葡聚糖是香菇多糖中主要活性成分，其含量是表征香菇多糖产品质量的主要指标之一。与苯酚硫酸法及刚果红法比较，本文建立的酸酶水解-HPLC法对于香菇多糖中β-D-葡聚糖的含量测定具有较好专属性，准确可靠，重复性好，可应用于香菇多糖产品的质量检测和监控。

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ABSTRACTA new method for determination of β-D-glucans content in Lentinan was developed by acidic and enzymatic hydrolysis coupled with high performance liquid chromatography(HPLC).Lentinan was hydrolyzed entirely to glucose with exo-1，3-β-glucanase and β-Glucosidase after partial acid hydrolysis for determination of total glucans by HPLC.α-Glucans in Lentinan samples were hydrolyzed to glucose with Amyloglucosidase and then also analyzed by HPLC.The content of β-D-glucan was calculated by the difference between total glucans and α-glucans.Moreover，the above method and phenol sulfuric acid method and Congo red method were used respectively to determine the content of glucans(or β-D-glucan)in laminarin，curdlan and yeast glucan samples whose β-D-glucan content were known.Compared the results from three methods，acidic and enzymatic hydrolysis coupled HPLC method were the most suitable for quantitative analysis of β-D-glucans in Lentinan.RSD of the method were 2.02%～2.94%.

Key wordsLentinan，β-D-glucan，acidic and enzymatic hydrolysis，HPLC

Detemination of β-D-glucan in Lentinan by Acidic and Enzymatic Hydrolysis Coupled HPLC

Yu Ya-juan，Dai Jun，Zhu Song，Chen Shang-wei，Jiang Bo
(Sate Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

硕士研究生(戴军教授为通讯作者)。

*国家自然科学基金(31171688)

2012-04-10，改回日期:2012-06-07