不同分子质量段小麦面筋蛋白酶解液对美拉德反应物风味的影响*

钟泓波，黄婵媛，尹文颖，赵谋明，崔春

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

不同分子质量段小麦面筋蛋白酶解液对美拉德反应物风味的影响*

钟泓波，黄婵媛，尹文颖，赵谋明，崔春

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

用超滤法将小麦面筋蛋白酶解液根据分子质量大小分为大于10 ku(M1)，5～10 ku(M2)，3～5 ku(M3)，1～3 ku(M4)，小于1 ku(M5)5个组分，研究这5个组分对美拉德反应产物风味的影响。结果表明，美拉德反应产物的主要风味物质是醛类，并且高分子量段美拉德反应产物中高级醛种类较多，而游离氨基酸和小分子寡肽参与美拉德反应主要生成吡嗪类风味物质。分子质量段为3～5 ku(M3)的膜分离组分，其美拉德反应产物鲜味氨基酸含量较高，苦味氨基酸含量较低，鲜味突出，醇厚味明显。

小麦面筋蛋白酶解液，美拉德反应，风味

小麦面筋蛋白(俗称谷朊粉，活性蛋白粉)是小麦淀粉生产的副产物，蛋白含量高，其中清蛋白占3%～5%，球蛋白占6%～10%，醇溶蛋白占40%～50%，谷蛋白占30%～40%。但是，因为小麦面筋蛋白分子疏水性强，溶解度低，限制了其应用范围[1-2］。为了提高和拓宽小麦面筋蛋白的功能特性，采用酶解技术手段对小麦面筋蛋白的蛋白质结构加以改造，可获得多肽组分[3］。

美拉德反应过程会生成大量的风味物质，在近几十年来一直是许多领域的研究热点。食品原料中一般都含有还原糖、淀粉、氨基酸，在加热过程中发生美拉德反应可产生具有各种香味特征的香味物质。Spanier的研究表明，美拉德反应产生特定风味化合物时，水解蛋白的游离氨基酸的组成与含量、分子量分布、多肽的组成及化学构型等对美拉德反应中形成的风味物质的种类等具有非常重要的影响[4-5］。近年来，国内外对小麦面筋蛋白的研究有一些报道[6-8］，但对于小麦面筋蛋白及其酶解液对美拉德反应风味的影响研究未见报道。

本研究利用超滤技术将小麦面筋蛋白酶解液分离为不同分子量段，分别与还原糖进行美拉德反应，采用气相色谱质谱联用分析产生的风味物质，研究不同分子量段酶解液对美拉德反应物风味的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麸皮、面粉，市售;小麦面筋蛋白，河南莲华味精集团;曲精，沪酿3.042米曲霉孢子粉，孢子发芽率≥80%，孢子数≥100亿/g干基，水分≤10%;超滤膜:截留分子量分别为 10000 u，5000 u，3000 u，1000 u;还原糖:木糖，广东汇香源生物科技股份有限公司;其他试剂均为分析纯。

恒温振荡培养箱BSD-150，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PHS-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司;密理博超滤系统，美国Millipore公司;DSQⅡ气相色谱质谱联用仪，美国Thermo公司;100 μm PDMS固相微萃取头，美国SUPELCO公司;高效液相色谱仪，美国Waters公司;R2L-100KPS真空冷冻干燥机，日本Kyowa公司;TIM840自动电位滴定仪，上海摩达科学器材公司;SHZ-82水浴恒温振荡器，金坛市恒丰仪器厂;GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米曲霉的培养

麸皮、面粉、水按照4∶1∶4的质量比装入250 mL锥形瓶中，塞上棉塞，121℃灭菌20 min，冷却接种，30℃恒温培养72 h。

1.2.2 酶液提取

将固态发酵成熟的米曲霉曲粉碎，过20目筛，加入10倍体积的去离子水，于40℃浸提30 min，滤纸过滤，即得粗酶液。向粗酶液中添加硫酸铵，使其饱和度达到40%，4℃静置过夜，冷冻离心。取上清液，并添加硫酸铵至其饱和度为80%，4℃静置过夜，冷冻离心，取沉淀，透析除盐，用福林酚比色法[9］测其中性蛋白酶活性。

1.2.3 酶解

在小麦面筋蛋白悬浮液中，加入米曲霉酶液，加酶量为800 U/g蛋白，于50℃酶解36h。100℃灭酶，并离心15 min，取上清液。此酶解液的氨基酸转化率为61.83%，蛋白质回收率为74.78%。其中氨基酸转化率为酶解液的上清液中氨基酸态氮的质量与上清液中总氮的质量之比，蛋白质回收率为酶解液的上清液中蛋白的质量与原料中蛋白的质量之比。

1.2.4 膜超滤工艺流程

取小麦面筋蛋白酶解液的上清液，冷却至25℃左右，取1500 mL的酶解产物依次通过MWCO为10、5、3和1 ku的膜，采用密理博超滤系统间歇式全回流操作工艺进行超滤分离，透过液进入下一级膜，而截留液循环进行分离。酶解产物通过膜超滤的详细流程参见图1。

图1 膜分离流程

1.2.5 冷冻干燥

将不同分子量段的酶解产物(原液，大于10 ku，5k～10 ku，3k～5 ku，1k～3 ku，小于1ku)进行冷冻干燥，并储存于-18℃。

1.2.6 美拉德反应

分别取经冷冻干燥的原液和各截留组分(大于10 ku，5k～10 ku，3k～5 ku，1k～3 ku，小于1 ku)4 g，与1 g木糖在120℃反应2 h，得到6个美拉德反应产物，分别命名为 M-control，M1，M2，M3，M4，M5。

1.3 分析方法

1.3.1 总氮含量的测定

凯氏定氮法[10］。

1.3.2 氨基酸分析

采用美国Waters高效液相色谱仪，PICO.TAG氨基酸分析柱，38℃，检测波长254 nm，流速为1 mL/min条件进行氨基酸分析。色氨酸的分析则是将样品碱解后再用HPLC分析。

参照 Hughes等[11］的方法，略微修改，操作如下:以异硫氰酸苯酯(PITC)进行柱前衍生化。将三乙胺(TEA)溶液(TEA-水-乙醇 =1∶2∶2，V∶V∶V)加到样品中，真空条件下挥发干，然后加入 PITC溶液(PITC-乙醇-TEA-水 =1∶7∶1∶1，体积比)室温下反应20 min。取50μL样品上柱，利用pH6.4醋酸钠缓冲液(洗脱液A)以及60%(v/v)乙腈水溶液(洗脱液B)进行梯度洗脱。洗脱步骤如下:0～10 min，线性洗脱(0～46%B);10～12 min，线性洗脱(46%～100%B);12～15 min，等速洗脱(100%B)。

1.3.3 SPME-GC-MS分析条件

色谱条件:色谱柱:Tr-35ms弹性石英毛细管(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序:初始温度40℃，保持2 min，以5℃/min升温至230℃，保持5 min。载气:He;载气流量:1.0 mL/min;分流进样，分流比10∶1。

质谱条件:离子源:EI离子源;离子源温度:250℃;传输线温度275℃;电子能量:70 eV;质量范围:m/z 33～450 amu。

萃取条件:CAR/PDMS萃取头270℃老化10 min。取美拉德反应产物5 g置于50 mL萃取瓶，加入10 mL饱和NaCl溶液，60℃振荡萃取30 min，230℃解吸3 min。

1.3.4 呈味分析

取各分子量段的美拉德反应产物，添加1%NaCl混合均匀，在常温下进行感官评定。根据国标GB/T 14195-1993 标准和 Ogansawara[12］、Lion 等[13］的方法，由10个有经验的专业人士根据不同酶解液比较打分。以谷氨酸钠溶液(鲜味，0.6 g/L)、蔗糖溶液(甜味，35 g/L)、乳酸(酸味，1.65 g/L)、L-异亮氨酸(苦味，5 g/L)为标准溶液进行感官评价。

2 结果与分析

2.1 不同分子量段的总氮含量

由表1可知，小麦面筋蛋白酶解液经膜分离后，大于10 ku的截留组分氮得率最高，并且氮得率随分子量的减少呈下降趋势。可能与超滤的原理有关，由于截留较大分子量组分时，超滤膜孔径大，所需压力小，酶液容易穿过，但随着截留组分分子量的逐渐减小，所需超滤膜的孔径也越来越小，超滤所需的压力就越来越大，并且需要更长的时间分离，因此，小分子量段的氮得率较低。

表1 膜超滤后各组分的总氮含量

2.2 不同分子量段小麦面筋蛋白酶解液的总氨基酸分析

肽的分子量大小以及氨基酸组成会影响到其美拉德反应产物的风味。由表2分析可知，原液以及小麦面筋蛋白酶解液各超滤组分中谷氨酸含量均最高，一般占总氨基酸的20%～40%，其中M2和M3中谷氨酸含量最高。原液以及小麦面筋蛋白酶解液各超滤组分中半胱氨酸含量均最低，且不同分子量段组分相差较大，M4组分中半胱氨酸含量仅为52.98 mg/100 mL，而M1组分中半胱氨酸含量达到256.57 mg/mL。

表2 各截留组分的氨基酸总量分析单位:mg/100 mL

2.3 不同分子量段美拉德反应产物风味分析结果

2.3.1 整体风味物质

图2 小麦面筋蛋白酶解物各组分美拉德反应产物的风味分析

由图2可知，原液以及各分子量段截留组分的美拉德反应产物中，醛类物质相对含量在50%以上，显著高于其他风味物质，是小麦面筋蛋白酶解液美拉德反应产物的主要风味物质，其中分子量在5k～10 ku的M2组分美拉德反应物中醛类风味物质含量最高，分子量大于10 ku的M1组分美拉德反应物次之，而分子量小于1 ku的M5组分美拉德反应物中醛类风味物质含量最低。小麦面筋蛋白酶解液原液以及各分子量段截留组分的美拉德反应产物中，酮类风味物质含量最低，一般不超过风味物质总量的5%，且各组分美拉德反应物相差不大。而对吡嗪、呋喃以及其他风味化合物而言，分子量小于1 ku的M5组分美拉德反应物含量较高，显著高于高分子量组分的美拉德反应物。由此可知，具有特征风味的杂环类物质，在小分子量段截留组分与还原糖反应时更易得到。

2.3.2 醛类物质

小麦面筋蛋白酶解液原液以及各分子量段截留组分的美拉德反应产物生成的风味物质中，醛的种类随着分子量的降低而呈减少趋势，其中M1组分中醛类物质的总类达到17种，而M5组分中醛类物质的种类最少，仅有10种，并且不含己醛、庚醛、辛醛、壬醛等高级醛。高级醛在较大分子量段截留组分中种类较多，如表3。然而特殊的风味一般存在于高级醛中，例如庚醛、辛醛等具有果子香味，壬醛具有玫瑰香味。在原液以及各分子量段截留组分的美拉德反应产物所检测出的醛类物质中，2-呋喃甲醛、苯甲醛、苯乙醛和3-甲基丁醛的含量较高。

表3 小麦面筋蛋白酶解物各组分美拉德反应产物风味物质中醛类物质的分析

2.3.3 吡嗪

随着分子量的降低，与还原糖进行美拉德反应生成的风味物质中吡嗪类的种类呈现增多的趋势，其中2，5-二甲基吡嗪含量最高。大分子量段截留组分M1、M2中仅含有2种吡嗪类物质，而小分子量段截留组分M5中含有吡嗪类物质高达15种，由此可知，游离氨基酸和小分子量寡肽参与美拉德反应主要生成吡嗪类风味物质，如表4。

表4 美拉德反应产物风味物质中吡嗪类物质的分析

2.4 不同分子量段美拉德反应组分的感官评价

由图3分析可知，就鲜味而言，感官强度大小为M3的鲜味最强，并且高于未经膜超滤的原液反应产物，其次为M-control、M2、M4、M1、M5;就持续性而言，M-control、M3、M4、M5感官持续性均较长，大分子量段截留组分M1、M2相对较差，分析原因可能是味蕾细胞更容易吸收较小分子;醇厚味方面，不同分子量段截留组分之间的评价差异并不明显，原液和M3醇厚味较好，其余各个组分基本一致;酸味方面，基本呈现随着分子量的减小，酸味强度增强的趋势，M1酸味最弱，M5最强，M-control酸味强度位于M1、M2之间;苦味方面，经膜分离后不同分子量段表现出苦味增强，均高于M-control，可能由于M-control中各组分拮抗或协同增效作用，苦味不是特别明显;甜味方面，M3的甜味最弱，其余各组分差别不大。

综上，M3的美拉德反应产物，因其具有较强的鲜味和醇厚，并且苦味、甜味最弱，而具有良好的潜力开发成呈味基料。

图3 各美拉德反应组分的感官评价

3 结论

小麦面筋蛋白酶解液经膜分离后，发现高分子量段含氮率增大。将不同分子量段的酶解液与还原糖进行美拉德反应，对产物进行风味分析，发现醛类物质是组成小麦面筋蛋白酶解液美拉德反应产物的主要风味物质，吡嗪类风味物质主要由游离氨基酸参与美拉德反应生成。

根据感官评价的结果，可知分子量段为3k-5 ku的膜分离组分，其美拉德反应产物鲜味最突出，醇厚味明显，并且从氨基酸分析可见其鲜味氨基酸含量较高，苦味氨基酸含量较低。

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ABSTRACTThe wheat gluten enzymatic hydrolysis was separated by membrane ultrafiltration into five fractions with different molecular weight as follows:more than 10 ku(M1)，5k-10 ku(M2)，3k-5 ku(M3)，1k-3 ku(M4)，less than1ku(M5).And the influence of five components of the Wheat Gluten Enzymatic Hydrolysis on the flavor of Maillard reaction products was investigated.The results showed that aldehydes were the main compounds contained in the Maillard reaction products(MRPs)from wheat gluten.And there were more varieties of senior aldehyde in high molecular weight than that in low molecular weight.Pyrazines were formed by free amino acids and oligopeptides reacted in the Maillard reaction.Compared with other components，in the MRPs of peptides between 3k and5ku(M3)had a better umami taste and mellow feeling due to its higher contents of amino acids with umami taste and lower contents of amino acids with bitter taste.

Key wordswheat gluten enzymatic hydrolysis，Maillard reaction，flavor

The Influence of Different Molecular Weight of the Wheat Gluten Enzymatic Hydrolysis on the Flavor of Maillard Reaction

Zhong Hong-bo，Huang Chan-yuan，Yin Wen-ying，Zhao mou-ming，Cui Chun
(College of Light Industry and Food Engineering，South China University of Technology，Guang Zhou 510640，China)

硕士研究生(崔春副教授为通讯作者)。

*中央高校(No.2012ZM0074);食品香料香精制备关键技术研究及产业化(No.2011BAD23B01)

2012-03-18，改回日期:2012-05-03