大孔树脂吸附分离蚕蛹ACE抑制肽的研究

李 勇，黄先智，阚建全，*，何 锦，张海娜

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；3.西南大学生物技术学院，重庆 400715；4.西南大学药学院，重庆 400715）

大孔树脂吸附分离蚕蛹ACE抑制肽的研究

李 勇1，2，黄先智3，阚建全1，2，*，何 锦1，2，张海娜4

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；3.西南大学生物技术学院，重庆 400715；4.西南大学药学院，重庆 400715）

为了找出大孔树脂纯化蚕蛹ACE抑制肽的方法。比较了5种大孔树脂在纯化蚕蛹ACE抑制肽时的吸附率和解吸率，得出DA201-C分离蚕蛹ACE抑制肽的效果最好。再进一步考察上样流速、上样浓度、分级洗脱等对DA201-C大孔树脂吸附及分离效果的影响。最终结果为75%乙醇洗脱下的多肽的ACE抑制率最高，其IC50为0.632mg/mL，并且发现疏水性与ACE抑制率呈正相关。

大孔树脂，DA201-C，ACE抑制肽，疏水值

Abstract：The purpose of this experiment was to find out the method of macroporous resin purifying pupa ACE inhibitory peptides.Through comparing the absorption rate and desorption rate of 5 kinds of macroporous resins in purifying pupa ACE inhibitory peptides，it was the result that DA201-C had the best effect in purifying pupa ACE inhibitory peptides.Further research of the impact of sample’s flow，concentration and graded elution on macroporous resin’s separating effect.The final conclusions were that when the ethanol elution concentration was 75%，the eluent had the highest ACE inhibition rate，whose IC50was 0.632mg/mL and it was found that hydrophobicity and ACE inhibition rate were positively correlated.

Key words：macroporous resin；DA201-C；ACE inhibitory peptides；hydrophobicity

大孔吸附树脂是一类新型非离子型高分子吸附剂，具有吸附能力大，容易再生，机械强度高等特点。大孔树脂主要通过分子间作用力如范德华力或氢键等对溶液中的分子进行吸附，用不同极性的洗脱溶液，就可得到不同极性大小和不同生物活性的组分。赵骏[1]等利用大孔树脂纯化乳酪蛋白源ACE抑制肽。周存山[2]等使用大孔树脂对麦胚蛋白降压肽进行脱盐处理。大孔树脂在分离纯化蛋白质、多肽和氨基酸等生物活性物质时具有条件温和、设备简单和操作方便的特性，有利于多肽的进一步纯化[3-4]。ACE抑制肽通过抑制人体肾素——血管紧张素系统中血管紧张素Ⅱ的生成而使血压降低。现因ACE抑制肽无毒副作用、来源广泛、效果明显的特点，目前已成为国内外研究的热点[5-7]。实验前期工作已用脱脂蚕蛹蛋白在碱性蛋白酶的作用下酶解，得到蚕蛹多肽液。为了进一步明确具有较高ACE抑制率多肽的性质，采用大孔吸附树脂分离蚕蛹多肽。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5种大孔树脂 沧州宝恩化工有限公司；Alcalase蛋白酶（20万U/g） 南宁东恒华道生物科技有限公司；ACE、HHL Sigma公司；乙腈（色谱纯）、氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯） 成都科龙化工试剂厂。

HH-6型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；LC-20AD型高效液相色谱仪、UV-2450PC型紫外可见分光光度计 日本SHIMADZU公司；ALPAAI-4LSC型真空冷冻干燥机 德国Sigma公司；DBS-100型电脑全自动部分收集器、HL-2型恒流泵上海沪西分析仪器厂；MiLLi-Qbiocel超纯水机 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大孔树脂的预处理 用无水乙醇浸泡处理24h后，抽滤，用无水乙醇淋洗至流出液遇水不产生白色浑浊，再用水洗尽乙醇。用3～5倍体积的5%HCl浸泡3h后，放尽酸液，用水洗至pH5～7；再用3～5倍的5%NaOH浸泡3h后，放尽碱液，水洗至中性，备用。

1.2.2 蚕蛹多肽的制备 取10g脱脂蚕蛹（采用索氏抽提：无水乙醚抽提12h）配制成12%底物，再用1mol/L的NaOH调节pH为9.5，再按照7%的加酶量加入碱性蛋白酶进行反应，保持温度稳定在50℃，酶解过程中不断滴加1mol/L的NaOH维持pH稳定。4h后停止反应，沸水浴10min后迅速冷却灭酶，5℃、8000r/min离心10min，收集上清液（其IC50为1.32mg/mL），冷冻干燥备用。

1.2.3 大孔树脂类型的选择 考虑D101、AB-8、DA201-C、HPD-400、HPD-826五种大孔树脂对蚕蛹多肽分离效果。在250mL具塞锥形瓶中加入5g处理好的干树脂，再加入10mg/mL的蚕蛹多肽溶液100mL，塞子塞好，在常温下振荡器中振荡（振荡速度为160次/min），吸附12h后，取出，过滤，测定吸附后滤液中的蛋白含量。再将吸附后的大孔树脂重新置于250mL具塞锥形瓶中，恒温振荡12h，取出，过滤，再测定滤液中的蛋白含量。比较5种树脂的吸附率和解析率。

1.2.4 DA201-C大孔树脂静态吸附动力学 在250mL具塞锥形瓶中加入5g处理好的干树脂，再加入10mg/mL的蚕蛹多肽溶液100mL，塞子塞好，在常温下振荡器中振荡（振荡速度为160次/min），间隔时间取样，测定溶液中的蛋白含量，计算树脂的吸附率（%）和吸附量（mg/g）[8]。

吸附率（%）=（原液蛋白浓度-吸附液蛋白浓度）/原液蛋白浓度×100

解析率（%）=（解析液蛋白浓度×解析液体积）/[（原液蛋白浓度-吸附液蛋白浓度）×吸附液体积]×100

吸附量（mg/g）=[（原液蛋白浓度-吸附液蛋白浓度）×溶液体积]/树脂重量×100

式中：原液蛋白浓度的单位为mg/mL；吸附液浓度的单位为mg/mL；溶液体积的单位为mL；树脂重量的单位为g。

1.2.5 上样流速对树脂吸附的影响 在层析柱中装满DA201-C大孔吸附树脂（2.6cm×50cm）室温条件下，将浓度为10mg/mL的蚕蛹多肽分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的A280nm，以A280nm=0.05为穿透点，比较不同流速时蚕蛹多肽的穿透体积。

1.2.6 上样浓度对树脂吸附的影响 在层析柱中装满DA201-C大孔吸附树脂（2.6cm×50cm）室温条件下，将浓度为10、30、50mg/mL的蚕蛹多肽以0.5mL/min的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的A280nm，以A280nm=0.05为穿透点，比较不同浓度时蚕蛹多肽的穿透体积。

1.2.7 DA201-C大孔树脂分级洗脱 室温条件下，用浓度为50mg/mL的蚕蛹多肽以0.5mL/min的流速流经层析柱（2.6cm×50cm），用紫外检测器检测流出液的A280nm，以A280nm=0.05为穿透点，停止上样。用纯水洗去未吸附的物质，之后分别用25%、50%、75%、100%的乙醇以2.0mL/min的流速流经层析柱，当A280nm吸光值小于0.05的时候停止洗脱，收集各洗脱峰。旋转蒸发后冷冻干燥，测定各组分的ACE抑制率。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基酸自动分析仪法 GB/T14965-1994。

1.3.2 蛋白质含量测定 半微量凯氏定氮法[9]。

1.3.3 ACE抑制率的测定 采用KUNIO S[10]的马尿酸高效液相色谱法。在37℃反应体系中依次加入80μL HHL液、降血压肽液、超纯水，每次测试的总体积为0.2mL，把以上混合液放入37℃恒温水浴中保温3min，然后加入一定量的ACE酶液（10μL）启动反应，恒温保持30min后，加入0.2mL 1mol/L HCl中止反应，至室温，取5μL反应产物进样，通过反相高效液相色谱洗脱图谱定量马尿酸的生成量，从而计算降血压肽的抑制率。

式中：S1—不存在降血压肽时的峰面积，S2—存在降血压肽与酶时的峰面积。

1.3.4 色谱条件 高压液相色谱系统：SHIMADZU LC-20AD；检测器：SPD-M20A；色谱柱：SHIMADZU VP-ODS 4.6mm×150mm；洗脱液：25%乙腈：75%超纯水；洗脱液流速：1mL/min；检测波长：228nm，进样量：5μL。

1.3.5 蛋白质或多肽疏水值的计算[11]

式中：AAi：100g蛋白质中各种氨基酸的含量，g；Mi：各种氨基酸的摩尔质量，g/mol；ΣAAi/Mi：100g蛋白质中氨基酸的总摩尔数，mol；△fti：氨基酸侧链疏水性值，kJ/mol；△Q：蛋白质的疏水性值。

1.4 数据处理

实验数据均是经过3次平行实验得到的平均值，并计算其误差，SPSS18.0分析数据之间的相关性，OriginPro7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 5种大孔树脂纯化蚕蛹ACE抑制肽对其吸附率和解吸率的比较

从图1可以看出，DA201-C的吸附率、解吸率都是最大的，其吸附率为45.79%，解吸率为66.43%。D101的吸附率、解吸率和DA201-C的比较接近，所以这两种树脂都比较适合用于分离蚕蛹多肽。从表1可以看出D101和DA201-C都是非极性树脂，但DA201-C的比表面积几乎是D101的一倍，而比表面积大的树脂对多肽有较多的吸附位点，有利于提高吸附效率。因此，选择DA201-C作为实验所用树脂。

图1 五种大孔树脂的吸附率和解析率的比较Fig.1 The difference of absorption rate and desorption rate of five macroporous resins

表1 DA201-C和D101大孔树脂的性质Table 1 Properties of DA201-C and D101 macroporous resins

2.2 DA201-C大孔树脂静态吸附动力学曲线

图2 DA201-C大孔树脂静态吸附动力学曲线Fig.2 Static adsorption kinetics curve of DA201-C to ACE-inhibitory peptide

从图2可以看出，随着吸附时间的增加，吸附液的吸光值逐渐降低，在吸附2h达到平衡，整个吸光值呈下降后趋于平缓的趋势，从而得出DA201-C大孔树脂对蚕蛹多肽的吸附属于快速平衡型。其动力学方程为：y=0.032x2-0.180x+0.485，R2=0.943。

2.3 蚕蛹ACE抑制肽的上样流速对DA201-C树脂吸附的影响

图3 上样流速对大孔树脂吸附率的影响Fig.3 The effect of flow on macroporous resin’s adsorption rate

从图3可以看出，流速为0.5mL/min时，其吸附率明显高于其他4个流速的吸附率，这表示上样流速越慢，大孔树脂的吸附效果就越好，但如果流速太慢会增加实验时间，影响实验进度，因此应该结合时间和流速一起考虑。本实验采用0.5mL/min作为蚕蛹ACE抑制肽的上样流速。

2.4 蚕蛹ACE抑制肽浓度对DA201-C树脂吸附的影响

从表2可以看出，蚕蛹多肽浓度越高，大孔树脂的吸附量就越大。由于动态吸附时间在不超过大孔树脂吸附容量的情况下，可以选择较大的浓度上样。当蚕蛹多肽浓度为50mg/mL时，其动态吸附量为3250mg；当浓度为55mg/mL时，其动态吸附量为3135mg，可看出55mg/mL时已超过了大孔树脂的吸附容量。故本实验选择50mg/mL浓度上样。

表2 不同上样浓度对树脂动态吸附量的影响Table 2 The effect of different concentrations on macroporous resin’s adsorption

2.5 DA201-C大孔树脂分级洗脱样品的氨基酸组成及ACE抑制率

由表3可知，随着洗脱剂乙醇浓度提高，洗脱组分的疏水值也在升高，75%乙醇洗脱组分具有最高的疏水值为5.98kJ/mol、100%乙醇洗脱组分的疏水值虽稍有降低，但与前面较低浓度相比，还是保持在一个较高水平上。与未分离的蚕蛹多肽相比，侧链疏水值10以上的氨基酸含量均有明显提高，并且随着乙醇浓度的提高，其洗脱组分的ACE抑制率也在变化，当乙醇浓度为75%时，其洗脱组分的ACE抑制率最高，达到57.79%（测定ACE抑制率时样品浓度为0.8mg/mL）。

2.6 乙醇分级洗脱组分疏水性与其ACE抑制率的关系

本实验进一步考察了各组分的疏水性值与ACE抑制率的关系，其结果见图4（测定ACE抑制率时样品浓度为0.8mg/mL）。从图4中可看出，相对于酶解液，各组分的ACE抑制率都有较大提高，且ACE抑制率随着多肽的疏水性的增加而变大，75%乙醇洗脱的多肽具有最大的ACE抑制率57.79%。

通过SPSS18.0分析疏水性值与ACE抑制率相关性见表4。从表4中可看出疏水性值与ACE抑制率的相关系数为0.899，具有显著相关（p=0.05），这表示疏水性值对蚕蛹多肽的ACE抑制率有较大影响。

表3 酶解液及乙醇梯度洗脱各组分的氨基酸组成、ACE抑制率和其疏水性值（g/100g蛋白）Table 3 Amino acid compositions，ACE inhibition rate and hydrophobicity of hydrolysate and ethanol delute fractions（g/100g protein）

表4 疏水性值与ACE抑制率的关系Table 4 The relationship between hydrophobicity and ACE inhibition rate

2.7 大孔树脂纯化后蚕蛹ACE抑制肽的IC50

将75%乙醇洗脱下的蚕蛹多肽液冷冻干燥成粉，再将其配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mg/mL的溶液，再测其ACE抑制率见图5。

图5 大孔树脂纯化后样品的IC50曲线图Fig.5 The curve of the IC50of samples after the purification of macroporous resin

从图5得到曲线方程：y=-21.74174x2+76.79228x+10.1188（R2=0.9999），由此可推算出最佳酶解条件的上清液的IC50=0.632mg/mL。

3 结论

综上所述，DA201-C大孔树脂可按疏水性的不同对蚕蛹多肽吸附分离。结果表明乙醇浓度在75%时，洗脱下的蚕蛹多肽具有最高的ACE抑制率57.79%，IC50为0.632mg/mL，与未经过大孔树脂纯化的蚕蛹多肽（IC50=1.32mg/mL）比较，其ACE抑制活性有了明显地提高，并发现疏水性与ACE抑制率呈正相关。经大孔树脂纯化后的蚕蛹ACE抑制肽还不是单一组分，还需要进一步分离纯化。

[1]赵骏，宫霞，郭本恒.乳酪蛋白源ACE抑制肽的分离纯化[J].中国乳品工业，2006，34（6）：8-11.

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Study on macroporous resin’s purification of pupa ACE inhibitory peptides

LI Yong1，2，HUANG Xian-zhi3，KAN Jian-quan1，2，*，HE Jin1，2，ZHANG Hai-na4
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China；3.College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400715，China；4.College of Pharmacy，Southwest University，Chongqing 400715，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）16-0281-05

2012－02－13 *通讯联系人

李勇（1986-），男，硕士研究生，研究方向：食品化学与营养学。

国家桑蚕产业技术体系蚕茧综合利用项目（CARS-22-ZJ0503）。