分散液液微萃取分光光度法测定食品中汞含量

王俊平，李家乐，王 硕，方国臻，李春江

（天津科技大学，食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457)

分散液液微萃取分光光度法测定食品中汞含量

王俊平，李家乐，王 硕*，方国臻，李春江

（天津科技大学，食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457)

建立了分散液液微萃取分光光度法测定食品中汞含量的方法。使用双硫腙、三氯甲烷、乙醇分别作为络合剂、萃取溶剂、分散溶剂，研究了萃取溶剂和分散溶剂体积、pH、络合剂浓度、萃取时间等影响因素。在最佳条件下，方法的线性范围为10～200ng·mL-1，相关系数（r)为0.9966，检出限为3ng·mL-1，对100ng·mL-1汞离子进行7次平行测定的相对标准偏差为4.3%。该方法可应用于鱼和茶叶中汞含量的测定。

分散液液微萃取，汞，双硫腙，紫外可见分光光度法

食品中汞含量的测定是食品污染物监测的重要项目。上世纪50年代至70年代，通过日本的“水俣病”事件，人们开始认识到汞的危害[1]。金属汞及甲基汞对人体健康的危害主要有神经毒性、肾脏毒性、免疫毒性、生殖毒性、胚胎发育毒性等[2]。传统的液液萃取分光光度法测定汞含量的方法具有操作繁琐、有机溶剂消耗量大、易造成环境污染等不足。Assadi等[3]提出了分散液液微萃取技术（Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)。该技术具有速度快、操作简便、成本低、回收率高、富集系数高、环境友好等优点。DLLME技术与电热原子吸收法[4-5]、火焰原子吸收法[6-7]、电感耦合等离子体发射光谱法[8-9]联用，实现了对多种金属离子的富集测定。这些方法虽然十分灵敏，但仪器购置费用和维护成本高，需要专业技术人员，不适用于日常监控。紫外可见分光光度法具有操作简便、成本低等优点。Gharehbaghi等[10]和Tabrizi等[11]将DLLME与紫外可见分光光度法结合，分别实现了对钴和铁的测定。本实验建立了分散液液微萃取分光光度法测定食品中汞含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

GBW08617汞单元素溶液标准物质 中国标准物质计量中心，1000μg·mL-1;二苯基硫代卡巴腙（双硫腙) 天津市光复精细化工研究所，分析纯;甲醇、乙醇、丙酮、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、抗坏血酸天津市北方天医化学试剂厂，分析纯;乙腈 天津科锐思精细化工有限公司，分析纯;二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷 天津市化学试剂二厂，分析纯;四氯乙烯 天津市威晨化学试有限公司，分析纯;盐酸、无水醋酸钠 天津市化学试剂一厂，分析纯;高氯酸、硝酸 天津市化学试剂五厂，分析纯。

Cary 50紫外可见分光光度计 澳大利亚Varian公司;MP 220酸度计 瑞士Mettler Toledo公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;5804 R离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分散液液微萃取过程 分散液液微萃取分光光度法富集测定汞离子过程：向15mL刻度离心管中加入0.75mL浓度为2μg·mL-1的汞离子标准工作液，用pH为2.0的盐酸溶液将体积调至10.0mL。然后加入0.6g氯化钠，轻轻摇晃。氯化钠溶解后，加入100μL 0.02mol·L-1EDTA-Na2溶液和200μL 1.0mol·L-1抗坏血酸溶液，然后加入45μL 1.0×10-3mol·L-1双硫腙乙醇溶液，反应1min，使其形成汞-双硫腙络合物。用5.0mL注射器将1.8mL乙醇（分散溶剂)和75μL三氯甲烷（萃取溶剂)的混合溶剂注入上述溶液中。然后在3500r/min转速下离心3min。使用注射器移去水层，用100μL微量注射器吸取离心管底部的有机相三氯甲烷（体积约为50μL)至光程为1cm、容积为500μL的比色皿，使用丙酮将其稀释至300μL。然后用分光光度计在波长495nm处以试剂空白作参比测定吸光度。试剂空白中不加汞离子标准工作液，其余试剂和操作与标准工作液的处理相同。

1.2.2 标准曲线的绘制 分别移取0.05、0.25、0.5、0.75、1.0mL浓度为2μg·mL-1的汞离子标准工作液于刻度离心管中，用pH为2.0的盐酸溶液将体积调至10.0mL。按照1.2.1的方法操作，测定吸光度后，绘制吸光度-浓度标准曲线并计算回归方程。

1.2.3 样品的消化与测定 鱼肉取可食部分打成匀浆，茶叶粉碎，保存于塑料瓶中备用。准确称取试样1.00～2.00g于高脚烧杯中，加入10.0mL硝酸和2.0mL高氯酸，盖上表面皿浸泡过夜。在电热板上小火加热，然后慢慢加大火力至溶液澄清无色或微带黄色，使溶液体积蒸发至1～2mL，冷却至室温。用少量水洗涤烧杯壁，用氨水将溶液pH调至2.0，将全部液体转移至10mL容量瓶，用pH为2.0盐酸水溶液定容。用10.0mL样品溶液替代1.2.1中体积调节至10.0mL后的汞离子标准工作液，按照1.2.1的方法操作。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

在400～700nm波长范围内对试剂空白和汞-双硫腙络合物的吸收光谱进行了测定。图1表明，丙酮作为参比溶剂时，试剂空白与络合物的最大吸收波长分别位于600、490nm处，Δλ=110nm，最大吸收波长差别较大，利于分光光度法测定。以试剂空白为参比时，络合物的最大吸收波长位于495nm处。本研究选择495nm作为测定波长。

图1吸收光谱Fig.1 Absorption spectra

2.2 萃取溶剂和分散溶剂的选择

萃取溶剂的种类是影响分散液液微萃取的重要因素。它通常需要满足密度比水大、在水中溶解度较小、对目标物有较高的萃取能力三个条件。分散溶剂要能够与水和萃取溶剂互溶，它可促使体系形成稳定的乳浊液并将萃取溶剂均匀地分散于水中，使萃取溶剂形成微小液滴，增大萃取溶剂与目标物的接触面积。分别使用200μL不同萃取溶剂（二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、四氯乙烯)和1.8mL不同分散溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、乙腈)进行实验。图2表明，在所有组合中，使用三氯甲烷和乙醇分别作为萃取溶剂和分散溶剂时吸光度最大。因此，本实验选择三氯甲烷作为萃取溶剂，乙醇作为分散溶剂。

图2 萃取溶剂和分散溶剂的选择Fig.2 Selection of the type of extraction and disperser solvent

2.3 萃取溶剂体积对吸光度的影响

研究了不同体积的三氯甲烷对吸光度的影响。随着三氯甲烷体积的增加，吸光度逐渐增大。当三氯甲烷用量为75μL时，吸光度达到最大。其用量为100、125μL时吸光度并没有继续增大。本实验选择三氯甲烷的用量为75μL。

2.4 分散溶剂体积对吸光度的影响

研究了不同体积乙醇对吸光度的影响。图3表明，随着乙醇用量从0.3mL增加至1.8mL，吸光度由0.12增加到0.54。当分散溶剂用量较少时，体系形成的乳浊液不稳定，萃取溶剂在水中形成的液滴较大并且快速沉降到离心管底部，导致萃取溶剂液滴与目标物的总接触面积较小且接触时间较短，所以萃取效率低。当乙醇体积为1.8mL时吸光度最大，随着其体积继续增加，吸光度又缓慢减小。这是因为分散溶剂体积过大时，络合物在水相中的溶解量也随之增加，故引起吸光度的下降。本实验选择乙醇的用量为1.8mL。

图3 乙醇体积对吸光度影响Fig.3 Effect of volume of ethanol on the absorption

2.5 酸度对吸光度的影响

样品溶液酸度不仅影响汞-双硫腙络合物的形成、配位数、稳定性，而且影响后续的分散液液微萃取过程。在pH为0.5～3.5范围内研究了酸度对吸光度的影响。图4中的结果表明，pH控制在2.0时吸光度最大。

图4pH对吸光度的影响Fig.4 Effect of pH on the absorption

2.6 络合剂用量对吸光度的影响

在本实验中，络合剂的作用体现在两方面：一方面，络合剂可以与汞离子发生络合反应生成络合物，疏水的络合物在分散液液微萃取过程中易于被萃取溶剂萃取;另一方面，络合剂作为金属离子显色剂，是分光光度法定量测定的基础。因此，络合剂的浓度直接影响络合物的形成、络合物的萃取以及分光光度法的信号强度。研究了不同浓度双硫腙对于汞离子测定的影响。结果表明，随着双硫腙浓度的增大，吸光度随之增大，当双硫腙浓度为4.5μmol·L-1时吸光度达到最大，然后趋于稳定。本实验选择双硫腙浓度为4.5μmol·L-1。

2.7 萃取时间对吸光度的影响

在分散液液微萃取技术中，萃取时间被定义为溶剂注射与离心分离两个操作步骤之间的时间间隔。研究了不同萃取时间对吸光度的影响。由图5可知，随着萃取时间由1min增加到5min，吸光度缓慢下降;在萃取时间由5min继续增加到15min过程中，吸光度下降的速度加快。以往的研究认为，在分散液液微萃取过程中，萃取溶剂被均匀分散为极小的液滴，萃取溶剂和水相之间的接触表面积趋于无限大，目标物从水相迁移至萃取溶剂的速度非常快，所以能够迅速达到萃取平衡态，因而萃取时间对分析信号不会产生明显的影响。但在本实验中，因为双硫腙自身稳定性较差，易被氧化分解，导致吸光度随萃取时间延长而下降。为了避免双硫腙的氧化分解，向体系中加入200μL 1.0mol·L-1的抗坏血酸溶液，体系吸光度虽然也随着萃取时间的延长有所下降，但下降速度明显减缓。为了控制吸光度的稳定，向体系中加入200μL 1.0mol·L-1的抗坏血酸溶液并把萃取时间控制在5min之内。

图5 萃取时间对吸光度的影响Fig.5 Effect of extraction time on the absorption

2.8 离心速率对吸光度的影响

溶剂注射之后体系形成“水/分散溶剂/萃取溶剂”乳浊液三元体系，疏水的萃取溶剂微小液滴悬浮于水中或者吸附在离心管内壁，需要通过离心实现分离。在不同离心速率（0～4500r/min)条件下离心3min。结果表明，随着离心速率的加快，吸光度增大。当离心速率达到3000r/min时，吸光度达到最大。继续增大离心速率，吸光度保持恒定。离心条件设定为转速3500r/min，时间3min。

2.9 盐效应

离子强度是影响传统液液萃取的重要因素。一般来讲，随着离子强度的增加，目标物和有机萃取溶剂在水相中的溶解度减小，利于提高回收率。在氯化钠浓度为0%～8%（w/v)范围内研究了离子强度对吸光度的影响。结果表明，吸光度随盐浓度的增大而增大，当盐浓度达到5%时吸光度达到最大，随后基本保持恒定。为了稳定体系的离子强度，选择氯化钠的加入量为6%（w/v)。

2.10 稀释溶剂

离心之后，离心管底部有机相三氯甲烷的体积仅有50μL，无法直接在比色皿中用分光光度法进行测定，需要选择合适的溶剂对有机相进行稀释。考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮四种常用稀释溶剂的效果。结果表明，用丙酮作稀释溶剂时吸光度最大。

2.11 干扰离子及干扰消除

在最佳实验条件下，研究了各种离子对50ng·mL-1汞离子测定的干扰。如果共存离子使测定结果偏离了±5%，这个浓度就可以认为是该共存离子的最大允许量。由表1可知，对测定干扰严重的有Cd2+、Cu2+、Ni2+、Pb2+。使用2×10-4mol·L-1EDTA-Na2作掩蔽剂可有效消除干扰。

表1 共存离子对汞测定的影响Table 1 Effect of foreign ions on the determination of mercury

2.12 分析特征量

汞含量在10～200ng·mL-1范围内符合朗勃比尔定律，回归方程为A=3.4784C（μg·mL-1)+0.0126，r=0.9966。检出限为3ng·mL-1（CL=3SB/m，其中CL为检出限，SB为对试剂空白进行7次测定所得吸光度的标准偏差，m为标准曲线的斜率)。对100ng·mL-1的汞离子进行7次平行测定，相对标准偏差为4.3%。

2.13 方法的应用

对不同样品进行处理和测定，并进行了加标回收实验。结果见表2，加标回收率在96.2%～103.0%之间，表明本方法准确度较高。

表2 实际样品中汞含量测定Table 2 Determination of mercury in real samples

3 结论

本实验将分散液液微萃取技术与分光光度法相结合，建立了食品中汞含量的测定方法。该方法具有简便、快速、仪器成本低等优点。方法的线性范围为10～ 200ng·mL-1，检出限为3ng·mL-1。该方法可应用于鱼和茶叶中汞含量的测定，回收率在96.2%～103.0%之间。

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Development of a dispersive liquid-liquid microextraction method for the spectrophotometric determination of mercury in food samples

WANG Jun-ping，LI Jia-le，WANG Shuo*，FANG Guo-zhen，LI Chun-jiang
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China)

Dispersive liquid-liquid microextraction（DLLME)technique combined with ultraviolet-visible spectrophotometry for the preconcentration and determination of mercury in food samples was developed. Dithizone，chloroform and ethanol were used as chelating agent，extraction solvent and disperser solvent，respectively.Some important DLLME parameters such as the volume of extraction and disperser solvent，pH，concentration of chelating agent and extraction time were investigated in detail.Under the optimized conditions，the calibration graph was linear from 10 to 200ng·mL-1with a correlation coefficient of 0.9966.The limit of detection was 3ng·mL-1and the relative standard deviation（n=7，for 100ng·mL-1of mercury)was 4.3%. The method was successfully applied into the determination of trace amounts of mercury in fish and tea leaves.

dispersive liquid-liquid microextraction;mercury;dithizone;ultraviolet-visible spectrophotometry

TS207.5+1

A

1002-0306（2012)16-0057-04

2011－12－30 *通讯联系人

王俊平（1969-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全检测。

“863”计划项目（2011AA100806)。