肿瘤坏死因子-β对重型再生障碍性贫血患者效应T细胞损伤骨髓造血的影响①

刘 晓 付 蓉 王 珺 王化泉 刘春燕 阮二宝 瞿 文 梁 勇 王国锦 王晓明 刘 鸿 吴玉红宋 嘉 邢莉民 关 晶 李丽娟 邵宗鸿 (天津医科大学总医院血液肿瘤科，天津300052)

获得性重型再生障碍性贫血(SAA)是一组以贫血、感染、出血为临床表现的重度骨髓衰竭性疾病，其发病与CD8+T淋巴细胞功能亢进导致骨髓造血细胞过度凋亡有关［1］。我们既往研究发现，SAA患者Ⅰ型淋巴因子白细胞介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ水平增高，CD8+T细胞比例增加、功能亢进，胞浆内产生肿瘤坏死因子(TNF)增加，血浆中TNF水平增高，且SAA患者外周血活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)亚群之一CD8+HLA-DR+T细胞比例明显增高，在SAA的免疫发病机制中发挥重要作用［2］。本研究拟体外混合培养SAA患者CD8+HLA-DR+T细胞(效应细胞)与正常人去除CD3+T细胞后的骨髓单个核细胞(BMMNC)(靶细胞)，并于培养体系中加入不同浓度TNF-β，通过检测靶细胞凋亡程度说明TNF-β对CD8+HLA-DR+T细胞损伤骨髓造血细胞的影响;同时检测培养上清中IFN-γ、IL-10水平，观察TNF-β对CD8+HLA-DR+T细胞分泌细胞因子的作用。

1 对象与方法

1．1 研究对象 病例为我科2011年2月至2011年7月收治的初诊SAA患者15例，男8例，女7例，中位年龄23(6～46)岁，诊断符合《血液病诊断及疗效标准》中SAA的诊断标准［3］。正常对照15名，均为正常健康人，男9名，女6名，中位年龄26(24～32)岁。研究方案已通过天津医科大学伦理委员会批准，所有研究对象均已签署知情同意书。

1．2 主要试剂与仪器 鼠抗人CD8、鼠抗人HLADR、鼠抗人CD3单克隆抗体及磁珠分选仪均为德国Miltenyi Biotec公司产品;鼠抗人PE-CD8、鼠抗人FITC-HLA-DR、鼠抗人 PE-IgG1、鼠抗人 FITC-IgG1单克隆抗体均为美国BD PharMingen公司产品;FITC标记的细胞膜联蛋白(Annexin V＆PI)细胞早期凋亡检测试剂盒为美国BD公司产品;IFN-γ、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒为美国RB公司上海分装产品;流式细胞仪为美国BD公司的BD FACSAria。

1．3 实验方法

1．3．1 细胞分选 用含肝素的试管取患者及正常成人骨髓10 ml，PBS 2倍稀释，以淋巴细胞分离液(比重1．077)密度梯度法分离BMMNC。

计数细胞，患者BMMNC约每1×107个细胞中加人20 μl CD8磁珠抗体，4℃孵育15分钟后，洗涤2次，磁性条件下过柱，脱离磁场，充分冲洗柱子，收集细胞。每1×107个细胞加入20 μl CD8解离抗体进行解离，5 μl终止抗体终止解离后，加入 20 μl HLA-DR抗体，4℃孵育15分钟，洗涤2次，磁性条件下过柱后，脱离磁场，充分冲洗柱子，收集细胞。正常成人BMMNC约每1×107个细胞中加人20 μl CD3磁珠抗体，4℃孵育15分钟后，洗涤2次，磁性条件下过柱，收集阴性细胞。

流式细胞仪检测分选细胞纯度。实验管加入上述分选所得细胞1×105、鼠抗人FITC-HLA-DR、PECD8各10 μl。对照管加入上述分选所得细胞1×105及相应同型对照各10 μl。4℃避光孵育20分钟，PBS洗涤2次，上机。

1．3．2 细胞培养 将上述分选所得 SAA患者CD8+HLA-DR+T细胞(效应T细胞)和正常人去除CD3+细胞的BMMNC(靶细胞)平均分成4份，以5×105ml－1细胞浓度置于24孔板中(CD8+HLADR+T细胞与靶细胞比例为1∶1)，实验组中加入TNF-β，使其终浓度分别为 15、25、50 ng/ml，每孔中加入12%灭活的小牛血清，用完全RPMI1640调整细胞悬液至每孔2 ml，置于37℃，5%CO2温箱中培养72小时。

1．3．3 细胞凋亡和细胞因子检测 应用Annexin V＆PI双标法标记细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率。应用ELISA试剂盒分别检测培养体系上清中IFN-γ、IL-10表达水平。

1．4 统计学处理 采用SPSS13．0统计软件进行分析，对符合正态分布且方差齐性的计量资料，用x±s表示，两组间比较采用配对t检验，以P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 流式细胞仪检测分选细胞 SAA患者效应细胞CD8+HLA-DR+细胞纯度均在90%以上，正常对照测定CD3－靶细胞比例在90%以上(图1)。

2．2 Annexin V＆PI检测靶细胞凋亡率 流式细胞仪Annexin V＆PI双染法检测靶细胞的凋亡情况(见图2)。左下象限(An－，PI－)代表正常活细胞;右下象限(An+，PI－)代表早期凋亡细胞;右上象限(An+，PI+)代表坏死细胞和晚期细胞凋亡;左上象限(An－，PI+)代表收集过程中出现的损伤细胞。从表1可见，15 ng/ml组凋亡率与空白组比较差异无统计学意义(P＞0．05);25 ng/ml组凋亡率高于空白组和15 ng/ml组(P均小于0．05);50 ng/ml组凋亡率显著高于空白组(P＜0．01)和15 ng/ml(P ＜0．05);但是 50 ng/ml组与 25 ng/ml组比较差异无统计学意义(P＞0．05)。

图1 流式细胞仪检测分选细胞Fig．1 Purity of cells by MACS

图2 流式细胞术检测细胞凋亡率Fig．2 Apoptotic rate measured by flow cytometry

表1 各组培养体系靶细胞凋亡率Tab．1 Apoptotic rate(AR)of each group

表2 培养体系上清中IFN-γ、IL-10浓度Tab．2 The levels of IFN-γ and IL-10 in culture supernatant of each group

2．3 ELISA法检测培养体系上清中IL-10、IFN-γ水平 IL-10水平各组间无显著差异(P＞0．05);50 ng/ml组上清中IFN-γ水平高于空白组(P＜0．05)，而15 ng/ml组和25 ng/ml组与空白组比较无差异(P ＞0．05)，如表2。

3 讨论

SAA是以骨髓造血功能衰竭和高病死率为特征的血液系统重症。近年来研究发现SAA患者的髓样树突细胞(mDC，DC1)数量增多，Th1/Th2细胞比例失衡，Th1细胞功能亢进，表现为CD4+T细胞比例增高、CD4+IFN-γ+细胞、CD4+IL-2+细胞比例增高，具有保护作用的NK细胞比例下降、造血负调控因子IFN-γ、IL-2等分泌增高、CTL比例增高，抗T细胞球蛋白(ATG/ALG)联合环孢菌素(CsA)的强化免疫抑制治疗(IST)可使近70%的患者达到完全缓解，进一步证实了SAA患者存在免疫激活及免疫耐受机制的异常，导致造血细胞过度凋亡，进而引起自身免疫性骨髓衰竭［4-9］。

CD8+HLA-DR+T细胞是活化的效应T细胞亚群之一，在T细胞介导的自身免疫性疾病(AID)如多发性硬化症(MS)、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)以及AIDS患者中比例升高，在HIV感染的患儿中比例明显降低［10，11］。既往我们研究显示，在SAA患者中CD8+HLA-DR+T细胞比例明显增高，并随患者病情缓解呈逐步下降趋势，可能是导致SAA骨髓衰竭的主要效应T细胞［2］。

TNF-β是由T淋巴细胞在抗原刺激下产生的淋巴因子，广泛参与炎症反应、细胞毒作用及免疫系统调节［12］。TNF分子激活后可引起受体寡聚从而增加与配体结合时的亲和力，在Fas分子相关蛋白(Fas-associated death dormain，FADD)分子的作用下，TNF与TNFR相互作用后，TNFR通过多聚化反应激活caspase级联反应，并可引起线粒体膜的改变，从而引发细胞凋亡。目前国内外关于TNF-α的研究较多，但缺乏TNF-β的相关报道。本研究发现TNF-β能增强SAA患者效应T细胞凋亡骨髓造血细胞的作用，并且呈浓度依赖性，但在较高浓度时其凋亡细胞作用并不随浓度增大而增高，在25 ng/ml与50 ng/ml间其凋亡细胞作用进入平台期，提示TNF-β也是CTL损伤骨髓造血靶细胞的重要途径之一。但该两组与空白对照组比较虽有统计学意义，然实际数值差别不大，或是体内TNF-β“温和”的发挥造血损伤作用的实际反应，该结论有待进一步研究证实。

INF-γ属Th1型细胞因子，通过激活单核细胞、淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞而调节免疫反应。Gidvani等［13］检测了与AID有关的细胞因子的单核苷酸多态性(SNP)，如 IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β1，发现 SAA患者均存在这些细胞因子的SNP，特别是IFN-γ和TNF-α，高度提示与SAA的发病有关。CTL一般通过三种方式杀伤靶细胞:细胞因子(TNF、IFN-γ)途径;穿孔素、颗粒酶 B途径;Fas-FasL途径［14］。本实验发现伴随 TNF-β 浓度增加细胞凋亡率增高，培养体系上清中IFN-γ浓度无相应变化，仅于50 ng/ml组有明显增加，说明高浓度的 TNF-β可促进 CD8+HLA-DR+T细胞分泌IFN-γ。

IL-10又称细胞因子生成抑制因子，淋巴细胞(包括CD4+和CD8+T淋巴细胞)、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞是其主要来源，具有强大的免疫抑制及免疫调控作用，在调节肿瘤免疫、炎症反应及自身免疫反应中具有多重作用。IL-10可以强化、延长体外激活的CTL的抗肿瘤作用，抑制并逆转T细胞的凋亡过程［15-17］。本实验显示，不同浓度TNF-β刺激下的CTL分泌IL-10水平无显著差异，提示IL-10对CTL的正反馈作用在CTL杀伤靶细胞的过程中并非重要机制。

综上所述，TNF-β在SAA患者CD8+HLA-DR+T细胞杀伤骨髓造血细胞过程中起重要作用，不仅是效应T细胞损伤靶细胞重要方式之一，并可通过加强效应T细胞分泌造血抑制性因子IFN-γ起正反馈调控作用。

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