白细胞介素27基因多态性与中国东北地区汉族人群支气管哮喘的相关性研究①

陈 爽 林 静 崔 善 张庆镐 (延边大学医学部，延吉133002)

支气管哮喘(简称哮喘)是世界范围内最为常见的慢性呼吸道疾病，其发病机制涉及遗传、环境、行为、心理和机体免疫等诸多方面因素。目前认为，Th1/Th2亚群数目和/或功能比例失衡与哮喘的发生、发展有密切的关系，而研究表明IL-27与Th1/Th2关系密切，因此，IL-27成为与哮喘相关的候选基因。从2007年开始陆续有学者报道IL-27启动子区的g.-964位点与哮喘患者易感性的相关性研究。其中chase等韩国学者发现IL-27的g.-964位点可能与韩国人群哮喘易感性相关［1］，张庆镐等发现IL-27p28基因多态位点g.-964可能与朝鲜族人群哮喘易感性相关［2］，而邱熔芳等［3］研究发现此位点与中国汉族人群哮喘无显著相关性。为明确IL-27p28基因中g.-964、g.2905和g.4730位点与哮喘人群的相关性是否具有民族差异和地区差异，本实验选用东北地区汉族200例哮喘患者和111例正常人血液，采用PCR法扩增目的基因片段，单碱基延伸法进行基因分型分析。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取200例中国东北地区汉族哮喘患者作为病例组，其中男82例，女118例，平均年龄32.8岁，来自延边大学附属医院和吉林市第二中心医院。所有患者符合哮喘的诊断标准:①反复发作喘息和呼吸困难、胸闷或咳嗽，多与接触变应原病毒感染运动或某些刺激物有关;②发作时双肺闻及散在或弥漫性以呼气期为主的哮鸣音;③上述症状可自行或治疗缓解;④排除可引起喘息或呼吸困难的其它疾病。所收集患者标本IgE﹥800 U/ml。对照组为111例中国东北地区汉族人，男69例，女42例，平均年龄27.8岁，为延边大学附属医院健康体检者。无过敏性哮喘及其他过敏性症状和病史。所有入选个体均为无血缘关系的汉族个体、长期生活在东北(生活在东北地区三代或以上)，无糖尿病、免疫系统疾病及HLA相关疾病及家族史。

1.2 方法

1.2.1 人基因组DNA的提取和纯化 病例组采用Bioteke凝固血基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计和合成 根据GeneBank上找到的IL-27的基因序列(NC-000016.9)，用软件primer5.0设计用于扩增的包含启动子区g.-964T＞C和外显子区g.2905T＞G，g.4730T＞C的3对引物。g.-964T＞C引物序列为 5＇-AATGTCCCGGCTGTGTCTGT-3＇(上游引物)，5＇-CTGTGCTGGAAGGGAGACCT-3＇(下游引物)，扩增片段的产物长度321 bp;g.2905T＞G引物序列为5＇-GCTCAGCCTGTTGCTGCTTC-3＇(上游引物)，5＇-CTCCACCAGCCCTCACTCAC-3＇(下 游 引物)，扩增片段的产物长度375 bp;g.4730T＞C引物序列 5＇-GGGTGTGATATGGCCATCCT-3＇(上游引物)，5＇-GCTCTACCTGGAAGCGGAGG-3＇(下 游 引物)，扩增片段的产物长度226 bp。

1.2.3 PCR扩增反应体系 10×PCR Buffer(contains no MgCl2)1.5 μl-1，MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)1 μl，Ampli Taq Gold(5 U/μl)0.2 μl，Template(50 ng/μl)2 μl，Primer F(20 pmol/L)0.4 μl，Primer R(20 pmol/L)0.4 μl，加灭菌去离子水补足至终体积15 μl。反应条件为94℃预变性 5分钟;94℃变性 30秒，65℃退火1分钟，72℃延伸45秒，每个循环温度递减0.5℃，共10个循环;94℃变性30秒，65℃退火1分钟，72℃延伸45秒，共30个循环;72℃延伸3分钟，4℃终止反应。取PCR产物1 μl加缓冲液0.5×TBE，1.0%琼脂糖凝胶电泳30分钟，溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)染色观察结果，分析PCR扩增情况。

1.2.4 PCR产物纯化 取100 μl灭菌去离子水到反应孔中，充分吹打混匀后，取100 μl到纯化板中，抽空。注意观察，勿抽过度。加灭菌去离子水100 μl，再次抽空。加灭菌去离子水补到原液量，摇床摇20分钟。震荡后离心1 000 r/min 3分钟。

1.2.5 测序 311例样本纯化后产物均进行测序，测序所用试剂盒BigDye Terminator v3.1，测序反应在ABI3730自动测序仪中进行，由国家人类基因组北方研究中心完成。

1.3 统计学处理 利用Hardy-weinberg平衡吻合度(HWE)检验统计出三个多态位点在哮喘组和对照组中预期的基因型频率，确定所选哮喘组和对照组是否可以代表东北汉族群体。基因型及等位基因频率用直接记数法依公式算出。应用SPSS17.0检测IL-27三个位点的基因型频率与等位基因频率在哮喘组及对照组中是否存在显著性差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增效果 IL-27p28的三个位点启动子区域的g.-964T＞C、外显子区域的g.2905T＞G和g.4730T＞C应用3对引物进行扩增。扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳20分钟，在凝胶成像分析仪下成像，所得PCR产物大小与预期的产物一致(图1)。

2.2 IL-27p28基因中查找SNP位点以及大样本基因分型 对正常人和哮喘患者样本IL-27p28基因启动子、外显子及其附近的内含子区域直接测序(图2～4)。根据 LD以及 SNPs的位置，在所有合格测序结果中选择其中g.-964A＞G互补链g.-964T＞C和g.2905T＞G、g.4730T＞C进行大样本基因分型。

图1 IL-27基因g.－964位点PCR产物电泳结果Fig．1 Electrophoresis result of PCR products on g.－964 site of IL-27 gene

图2 IL-27p28基因g．－964T＞C位点PCR产物测序图(TC杂合型)Fig．2 Sequencing map of IL-27p28(g．－ 964T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

图3 IL-27p28基因g．2905T＞G位点PCR产物测序图(TT纯合型)Fig．3 Sequencing map of IL-27p28(g．2905T ＞ G)gene PCR products(TT homozygous)

图4 IL-27p28基因g．4730T＞C位点PCR产物测序图(TC杂合型)Fig．4 Sequencing map of IL-27p28(g．4730T ＞ C)gene PCR products(TC heterozygous)

表1 哮喘组与对照组基因型及等位基因频率Tab．1 Genotype and allele frequencies in asthma and control groups

2.3 IL-27p28的SNPs与哮喘的相关性分析 本实验对200名哮喘患者和111名正常人进行检测。由于样本为三个多态位点均符合Hardy-weinberg遗传平衡定律P＞0.05，证明所收集样本可以代表群体。组间基因型及等位基因的比较运用SPSS17.0进行统计，结果IL-27p28的 g.-964T＞C、g.2905T＞G和g.4730T＞C的基因型及等位基因频率的分布在正常对照组和哮喘组之间的分布均无显著性差异(表1)。

3 讨论

白细胞介素27(Interleukin 27，IL-27)是由P28和EBi3两个片段组成的异源二聚体，在抗原呈递细胞(APC)上有较高水平表达，主要作用于固有免疫系统和适应性免疫系统的各种细胞而发挥广泛的免疫调节作用，尤其在调节CD4+T细胞分化与增殖方面具有重要作用［4］。已知CD4+T细胞活化后，在不同细胞因子的作用下可分化为Th1或Th2，Th1细胞可产生IFN-γ，促进细胞免疫;Th2细胞分秘IL-4，促进体液免疫。Th1和Th2细胞可通过分泌的细胞因子而互相抑制其分化和增殖，Th2型细胞应答亢进是Ⅰ型超敏反应的主要致病机制，而支气管哮喘恰恰是典型的Ⅰ型超敏反应性疾病。IL-27能协同IL-12促进初始CD4+T细胞产生IFN-γ，并促进 Th0细胞向 Th1 细胞分化［5，6］;同时，IL-27 还具有抑制效应Th2细胞功能的作用［7］。因此，IL-27很有可能成为较好的治疗Ⅰ型超敏反应性疾病的细胞因子。

Th1/Th2失衡学说是哮喘发作的重要免疫学发病机制，在体外实验中，IL-27可以通过诱导T-bet和IL-12Rβ2的表达启动初始T细胞向Th1的分化［8，9］，另外，IL-27 可以抑制 Th2 特异性转录因子GATA3的表达，因而IL-27能够使Th1/Th2平衡向Th1漂移。而体内研究发现，IL-27对免疫反应有负反馈调节作用，IL-27ra-/-小鼠在受到病原体刺激时，会引起持续的Th1活化，最终导致组织器官损伤，甚至死亡［10，11］，因此，IL-27 对于抑制过度的免疫反应有着重要的意义。综上所述，IL-27在维持Th1/Th2平衡及抑制过度免疫方面有着重要作用，而IL-27的表达异常有可能导致免疫性疾病的发生。

随着全基因组关联分析方法大规模的应用，越来越多的哮喘易感基因被鉴定，但由于各种外在和内在因素的作用，使这些结果需要在不同的人群中进行重复和验证。实验对g.-964A＞G、g.2905T＞G、g.4730T＞C的3个位点多态性进行研究，通过病例-对照研究对IL-27基因单核苷酸多态位点进行分析，未测到3个多态位点与中国东北汉族人群哮喘相关。g.-964A＞G检测结果正与中国学者对汉族人的检测相一致，与对朝鲜族人检测的结果有所不同，故怀疑g.-964 A＞G位点与哮喘易感性之间的关系可能具有种族特异性，所以该位点在汉族和朝鲜族人群之间重复性有差别。而g.2905T＞G、g.4730T＞C两个位点在汉族和朝鲜族人群中基因多态性与支气管哮喘均无相关性，因此这两个位点可能不是哮喘易感性的相关位点。支气管哮喘是多因素诱发的疾病，目前临床上无较好的预防和根治的办法，IL-27基因多态性与哮喘相关性的研究为哮喘的预防提供了新的遗传学研究方向，有望成为部分人群诊断和预防支气管哮喘的一种依据。

1 Chase S C，Li C S，Kim K M et al.Identification of polymorphisms in human interleukin-27 and their association with asthma in a Korean population［J］.J Hum Genet，2007;52(4):355-361.

2 单元春，崔 善，张庆镐et al.IL-27p28基因多态性与中国朝鲜族人群哮喘的相关性［J］.中国生物制品学杂志，2011;24(4):435-438.

3 邱熔芳，李际盛，高贵敏et al.IL-27p28基因启动子区域-964A＞G位点多态性与中国汉族人群支气管哮喘的相关性［J］.山东大学学报:医学版，2008;46(11):1021-1023，1027.

4 Pflanz S，Hibbert L，Mattson J et al.WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducting receptor for IL-27［J］.J Immumol，2004;172(4):2225-2231.

5 Hölscher C，Hölscher A，Rückerl D et al.The IL-27 receptor chain WSX-1 differentially regulates antibacterial immunity and survival during experimental tuberculosis［J］.J Immunol，2005;174(6):3534-3544.

6 Pirhonen J，Siren J，Julkunen I et al.IFN-α regulates Toll-like receptor-mediated IL-27 gene expression in human macrophages［J］.J Leukoc Biol，2007;82(5):1185-1192.

7 Miyazaki Y，Inoue H，Matsumura M et al.Exacerbation of experimental allergic asthma by augmented Th2 responses inWSX-1-deficientmice［J］.J Immunol，2005;175(4):2401-2407.

8 Hibbert L，Pflanz S，De Waal Malefyt R et al.IL-27 and IFN-alpha signal via Stat1 and Stat3 and induce T-Bet and IL-12Rbeta2 in native T cells［J］.J Interferon Cytokine Res，2003;23(9):513-522.

9 Lucas S，Ghilardi N，Li J et al.IL-27 regulates IL-12 responsiveness of native CD4+T cells through Stat1-dependent and-independent mechanisms［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003;100(25):15047-15052.

10 Hamano S，Himeno K，Miyazaki Y et al.WSX-1 is required for resistance to Trypanosoma ceruzi infection by regulation of Proinflammatory cytokine production［J］.Inununity ，2003;19(5):657-667.

11 Rosas L E，Satoskar A A，Roth K M et al.Interleukin-27R(WSX-1/T-cell cytokine receptor)gene-deficient mice display enhanced resistance to leishmania donovani infection but develop severe liver immunopathology［J］.Am J Pathol，2006;168(1):158-169.