经链球菌菌体制剂OK-432刺激的树突状细胞对自然杀伤细胞增殖及功能的影响

于丽梅 陈剑群 陈复兴 刘军权 周忠海 陈 玲

(徐州医学院附属医院消化科，徐州221002)

肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，为我国第2位恶性肿瘤致死病因，世界各地的肝癌每年新增病例约100万［1］。早期通过手术、移植或介入等，5年生存率虽可达到70%左右;但2年复发率依然高达50%，且现有治疗手段疗效均欠佳［2］。因此如何提高肝癌患者的生存状况，是肿瘤学界面临的严峻挑战［3］。溶血性链球菌菌体制剂OK-432作为GMP(Good manufacturing products)级的免疫生物效应修饰剂和处方药，早已用于治疗各种肿瘤［4］。OK-432可增强 NK细胞、淋巴细胞等细胞的细胞毒作用，并促进干扰素、IL-2、TNF-α等的分泌，调节机体的抗肿瘤免疫反应［5］。较其它DC成熟诱导剂相比，促进未成熟树突状细胞(immature DC，imDC)成熟的能力更强，而且具有更好的应用前景［6-10］。近年肿瘤免疫治疗已成为一种新的治疗模式，而在肿瘤免疫中NK细胞构成第一道免疫杀伤防线，具有很强的细胞毒作用，而树突状细胞是人体内抗原递呈功能最强的细胞，是启动、调控、维持免疫反应的中心环节［11，12］。DC和NK细胞之间存在复杂的双向通信，两者的相互作用不仅影响了免疫反应的启动，而且决定其结局。其中应用DC与NK细胞体外共培养后联合输注治疗恶性肿瘤的研究越来越受到重视。本研究探讨OK-DC对NK细胞扩增及其功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 胎牛血清(FCS)、RPMI1640培养基购于Gibco公司;重组人白细胞介素2(rhIL-2)购自厦门特宝生物工程股份有限公司;OK-432购于山东鲁抗制药公司;噻唑蓝(MTT)、DMSO(二甲亚砜)、FITC标记的CD16/CD56购于Sigma公司;鼠抗人PE 标记的 CD1a、CD3、CD86、CD80，鼠抗人 FITC 标记的CD83购于BD公司;乳酸脱氢酶试剂盒购于日本世诺临床诊断制品株式会社;PE标记的穿孔素、颗粒酶B及APC标记的鼠抗人CD107a购于杭州联科生物;人肝癌HepG2细胞株由徐州医学院肿瘤科实验室液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人类外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离、DC 培养［13］，于第6天时将DC分2组:(1)imDC组:不加OK-432;(2)OK-DC组:加入终浓度为5μg/ml的OK-432。48小时后FCM检测CD1a、CD83高表达，收获DC与NK细胞混合培养。

NK细胞培养用含10%FCS的RPMI1640培养液调整人PBMC浓度为2×105ml－1，加入6孔板，每孔4 ml，并加入 rhIL-2(终浓度 500 U/ml)，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每3天半量换液并补足rhIL-2。

1.2.2 实验分组 NK细胞于培养8天后收集细胞，分组处理如下:(1)对照组:单纯NK组;(2)OKDC 组:OK-DC 与 NK 细胞以 1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的比例混合;(3)imDC组:imDC与NK细胞以(2)的比例分组，补充相应的细胞因子。

1.2.3 MTT法检测OK-432对DC增殖影响 取培养6天的DC，接种于96孔板中，0.2 ml/孔，细胞浓度为1 × 106ml－1，于 37℃、5%CO2培养箱中培养。加入 OK-432(终浓度分别为 80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15 μg/ml)，同时设不加药物的对照组，每组5个复孔。孵育48小时后每孔加MTT液(5 mg/ml)20 μl，于 37℃、5%CO2培养箱中培养4小时，弃上清，加入DMSO 150μl，在570nm波长酶标仪上测定各孔光密度值(OD)。细胞增殖率=(实验组A值/对照组A值－1)×100%。

1.2.4 NK 细胞增殖检测 分别于共培养 0、2、4、6天取少许细胞悬液用台盼蓝拒染法检测细胞存活率，并进行细胞计数。每样本NK细胞扩增倍数=计数时细胞总数×本样本CD3－CD16+56+表达百分率/(初始细胞数×初始细胞CD3－CD16+56+表达百分率)。

1.2.5 FCM检测DC表型表达 收集各组DC，调整细胞浓度为 1×107ml－1，按照试剂说明加入CD80、CD83、CD86 抗体，37℃避光孵育 15 分钟，洗涤后流式细胞仪检测表型表达情况。

1.2.6 FCM 检测 NK 细胞表面 PFP、GraB、CD107a表达 收集各组细胞，每管加入相应量CD3、CD56抗体及PFP、GraB、CD107a抗体，混匀后室温暗处结合15分钟，离心后加入PBS重悬细胞，然后上机检测。

1.2.7 LDH释放法检测NK细胞杀伤活性 收集经DC作用的NK细胞和本室液氮复苏后的HepG2细胞，生理盐水洗涤，调整各组NK细胞和HepG2细胞浓度分别为2 ×106ml－1和2 ×105ml－1，使效靶细胞比例为10∶1。混合后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时，1500 r/min离心10分钟，收集上清液。全自动生化分析仪340 nm波长下测定上清液吸光度值(A)，每样本设5个复管。杀伤活性(%)=(A实验组-A效应细胞自然释放组)/(A靶细胞最大释放组-A靶细胞自然释放组)×100%。

2 结果

2.1 OK-432对 DC增殖的影响 OK-432(5 μg/ml)作用DC 48小时后，DC的增殖率较对照组和其它各个浓度组显著增高，增殖达到最佳(30%)，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间比较无显著差异。OK-432浓度超过5 μg/ml和低于5 μg/ml时DC的增殖率均逐渐下降，见图1。

2.2 NK细胞扩增 NK和DC共培养第4天时1∶5(OK-DC)组、1∶20(OK-DC)组 NK 细胞扩增倍数明显高于对照组，并高于同比例未处理组，差异有统计学意义(P＜0.05);于第6天时1∶5(OK-DC)组NK细胞扩增倍数达最大，且高于1∶20(OK-DC)组和其它各组(P ＜0.05)，见表1。

2.3 DC免疫表型检测 处理组较对照组能显著增强 CD80、CD83、CD86 的表达(P ＜0.05);5 μg/ml组与对照组、1.25 μg/ml组、20 μg/ml组相比，CD80、CD83、CD86分子的表达有显著差异(P＜0.05)，见表2 及图2 ～4。

图1 不同浓度OK-432对DC增殖的影响(±s，n=5)Fig.1 The effect of different concentrations of OK-432 on DC growth(±s，n=5)

表1 NK细胞增殖倍数Tab.1 The multiplication of NK cells

2.4 NK细胞释放 PFP、GraB、CD107a的检测 NK与DC共培养4天后，各组释放 PFP、GraB、CD107a较对照组明显上升，差异有统计学意义(P＜0.05);1∶5(OK-DC)组与1∶5(imDC)组两组间相比有显著差异(P ＜0.05)，1∶20(OK-DC)组与1∶20(imDC)组两组间也有明显差异(P＜0.05);1∶5(OK-DC)组与1∶20(OK-DC)组两组相比有明显差异(P ＜0.05)，见表3。

表2 不同浓度OK-432刺激的DC表型表达Tab.2 The expression of CD80，CD83 and CD86 of DC stimulated by different concentrations of OK-432

图2 OK-432作用于DC 48小时后的CD80检测结果Fig.2 The CD80 expression of DC stimulated by OK-432 after 48 hours

图3 OK-432作用DC 48小时后CD80的表达(±s，n=5)Fig.3 The CD80 expression of DC cultured with OK-432 for 48 hours(±s，n=5)

图4 OK-432作用于DC 48小时后的CD83、CD86检测结果Fig.4 The CD83，CD86 expression of DC stimulated by OK-432 after 48 hours

表3 NK细胞PFP、GraB、CD107a的流式检测结果Tab.3 The FCM result of PFP，GraB，CD107a in the NK cells

2.5 NK细胞杀伤活性的检测 NK与DC共培养4天后，1∶5(OK-DC)组对HepG2细胞的杀伤活性(67.12±5.36)%达到最大，显著高于对照组的(50.23 ± 4.02)%、1∶5(imDC)组的(63.11 ±5.46)%和1∶20(OK-DC)组的(58.42 ±4.31)%，差异有统计学意义(P＜0.05);1∶20(OK-DC)组与1∶20(imDC)组两组的杀伤活性(58.42 ±4.31)%、(55.34 ±3.43)%相比差异显著(P ＜0.05)，各实验组与对照组比较亦有显著差异(P＜0.05)。

3 讨论

在肝癌患者过继免疫治疗中，NK细胞显示出一定抗肿瘤疗效。NK细胞可以在细胞、分子及基因水平抑制肿瘤转移及复发，具有天然杀伤肿瘤细胞的能力，最新研究发现NK细胞还具有适应性免疫的特性［14，15］。

Buentke等［16］通过取感染马拉色霉菌的患者皮肤NK和DC组织，观察到密切接触DC的NK细胞明显增多，首次揭示NK、DC在体内具有相互作用。目前研究发现在感染或肿瘤免疫应答中均发现NK细胞与 DC 之间有相互作用［17］。Granucci等［18］指出DC分泌的IL-2可以促使NK细胞活化，而且IL-2似乎比白细胞介素12(IL-12)或白细胞介素18(IL-18)更能诱导它产生干扰素 γ(Interferonγ，IFN-γ)。将NK细胞和未致敏DC通过过继免疫的方法联合输入肿瘤病人体内，可增加二者直接接触和相互作用的机会，制造一种“适宜的免疫微环境”，促使NK直接杀伤肿瘤细胞，释放抗原，并利用DC天然的抗原识别、加工和提呈能力，诱发DC特异性致敏，促使DC成熟，启动初始免疫，进而推动继发免疫的进行，诱导特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫应答。NK细胞杀伤靶细胞主要是通过PFP和GraB引起靶细胞的裂解［19］。穿孔素是存在于NK细胞胞质中的细胞毒颗粒，能以钙离子依赖方式在靶细胞膜上形成跨膜通道，导致靶细胞渗透性溶解［20］。GraB不能单独进人靶细胞内，它必须在PFP使靶细胞形成孔后才能通过孔进入，并激活膜上的蛋白酶而引发凋亡［21，22］。研究认为，穿孔素能够降低内体膜稳定性从而促进GraB的内化及释放［23］。GraB具有天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性，除可在胞浆中激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinasparate protease，Caspase)级联反应启动细胞凋亡外，还可直接迁移至细胞核降解脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)，诱导Caspase非依赖的细胞死亡［24］。此外，NK细胞表面表达Fas配体(Fas ligand，FasL)和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related opoptosis-inducing ligand，TRA IL)可通过与靶细胞上的受体结合引起靶细胞的凋亡。NK细胞也可被肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)激活杀伤靶细胞［25］。

本实验证实OK-432(终浓度5 μg/ml)促进DC增殖并促进CD80、CD83、CD86的高表达，也即能促进DC成熟。因为DC只有经促成熟因子作用，才能成为成熟 DC，并且高表达 CD1a、CD80、CD83、CD86等分子，其中CD83是DC成熟的标志。DC和NK细胞共培养过程中，1∶5组NK细胞扩增倍数明显高于其它各组，且同比例OK-DC组扩增明显高于im-DC组，证实OK-DC能以剂量依赖的方式增加NK细胞的扩增倍数。研究发现CD107a是NK细胞活化的一个重要标志，与细胞毒活性密切相关，可作为NK 细胞功能活性的指标［26，27］，且 CD107a 表达水平的上调与NK细胞分泌细胞因子的增多及NK细胞对靶细胞的杀伤作用的增强高度相关。本实验1∶5(OK-DC)组释放 PFP、GraB、CD107a与其它各组相比差异显著，证实了OK-DC能以剂量依赖的方式增强NK细胞的功能，以1∶5比例达到最佳。这也符合 Piccioli等［28］观点，NK、DC 通过细胞间的直接接触起作用，而且以1∶5的最佳比例起作用。NK、DC相互作用不仅存在作用部位差异，还存在接触依赖性和剂量依赖性。LDH释放法检测NK细胞杀伤活性，显示1∶5(OK-DC)组对HepG2细胞的杀伤活性达到最大。提示NK细胞和DC共培养能增强NK细胞的功能，从而增强了NK细胞杀伤肝癌细胞的活性，可能与增加 NK扩增倍数和 PFP、GraB、CD107a的表达有关。

OK-DC与NK细胞共培养在肿瘤免疫治疗中的研究目前尚未有系统报道，因此两者的共作用有望成为肿瘤免疫治疗的新热点。

1 Schütte K，Bornschein J，Malfertheiner P.Hepatocellular carcinoma--epidemiological trends and risk factors［J］.Dig Dis，2009;27(2):80-92.

2 Rahbari N N，Mehrabi A，Mollberg N M et al.Hepatocellular carcinoma:current management and perspectives for the future［J］.Ann Surg，2011;253(3):453-469.

3 Aravalli RN，Steer C J，Cressman E N.Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma［J］.Hepat Ology，2008;48(6):2047-2063.

4 Okamoto M，Ohe G，Furuichi S et al.Enhancement of anti-tumor immunity by lipoteichoic acid-related molecule isolated from OK-432，a streptococcal agent，in athymic nude mice bearing human salivary adenocarcinoma:role of natural killer cells［J］.Anticancer Res，2002;22(6A):3229-3239.

5 Fujimoto T，Duda R B，Szilvasi A et al.Streptococcal preparation OK-432 is a potent inducer of IL-12 and a T helper cell 1 dominant state［J］.J Immunol，1997;158(12):5619-5620.

6 Ogihara T，Iinuma H，Okinaga K.Usefulness of immuno-modulators for maturation of dendritic cells［J］.Int J Oncol，2004;25(2):453-459.

7 Nakahara S，Tsunoda T，Baba T et al.Dendritic cells stimulated with a bacterial product，OK-432，efficiently induce cytotoxic T lymphocytes specific to tumor rejection peptide［J］.Cancer Res，2003;63(14):4112-4118.

8 Tamada K，Harada M，AbeK et al.Antitumor vaccination effect of dendritic cells can be augmented by locally utilizing Th1-type cytokines from OK432-reactive CD4+T cells［J］.Cancer Immunol Immunother，1998;46(3):128-136.

9 Itoh T，Ueda Y，Okugawa K et al.Streptococcal preparation OK-432 promotes functional m aturation of human monocyte-derived dendritic cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2003;52(4):207-214.

10 Sakakibara M，Kanto T，Inoue M et al.Quick generation of fully mature dendritic cells from monocytes with OK-432，lowdose prostanoid，and interferon-alpha as potent immune enhancers［J］.J Immunother，2006;29(1):67-77.

11 Kim R，Emi M，Tanabe K.Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape［J］.Immunology，2007;121(1):1-14.

12 Chijioke O，Munz C.Interactions of human myeloid cells with natural killer cell subsets in vitro and in vivo ［J］.J Biomed Biotechnol，2011;(251679):1-7.

13 黄红艳，王 营，陈复兴et al.姜黄素诱导的免疫耐受性人树突状细胞的研究［J］.中国免疫学杂志，2011;27(7):612-613.

14 Hoover R G，Gullickson G，Kornbluth J.Impaired NK cytolytic activity and enhanced tumor growth in NK lytic-associated molecule-deficient mice［J］.J Immunol，2009;183(11):6913-6921.

15 Sun J C，Beilke J N，Lanier L L.Adaptive immune features of natural killer cells［J］.Nature，2009;457(7229):557-561.

16 Buentke E，Heffler L C，Wilson J L et al.Natural killer and dendritic cell contact in lesional atopic dermatitis skin-Malassezia-influenced cell interaction［J］.J Invest Dermatol，2002;119(4):850-857.

17 Schmitz M，Zhao S，Deuse Y et al.Tumoricidal potential of native blood dendritic cells:direct tumor cell killing and activation of NK cell-mediated cytotoxicity［J］.Immunol，2005;174(7):4127-4134.

18 Granucci F，Zanoni I，Pavelka N et al.A contribution of mouse dendritic cell-derived IL-2 for NK cell activation［J］.J Exp Med，2004;200(3):287-295.

19 Suwa T，Saio M，Umemura N et al.Preoperative radiotherapy contributes to induction of proliferative activity of CD8+tumor-infiltrating T-cells in oral squamous cell carcinoma［J］.Oncol Rep，2006;15(4):757-763.

20 Urrea M R，Gil J，Rodriguez-Sainz C et al.Functional assessment of perforin C2 domain mutations illustrates the critical role for calciumdependent lipid binding in perforin cytotoxic function［J］.Blood，2009;113(2):338-346.

21 0zdemir O，Savasan S.Combinational IL-2/IL-15 induction does not further enhance IL-15 induced lymphokine-activated killer cell cytotoxicity against human leukemia/lymphoma cells［J］.Clin Immunol，2005;115(3):240-249.

22 Takata H，Takiguchi M.Three memory subsets of human CD8+T cells differently expressing three cytolytic effector molecules［J］.J Immunol，2006;177(7):4330-4340.

23 Keefe D，Shi L，Feske S et al.Perforin triggers a plasma membranerepair response that facilitates CTL induction of apoptosis［J］.Immunity，2005;23(3):249-262.

24 Lord S J，Rajotte R V，Korbutt G S et al.Granzyme B:a natural born killer［J］.Immunol Rev，2003;193(1):31-38.

25 Fietta P，Delsante G.Focus on human natural killer cells［J］.Riv Biol，2009;102(2):219-235.

26 Alter G，Malenfant J M，Altfeld M.CD107a as a functional maker for the identification of natural killer cell activity［J］.J Immunol Methods，2004;294(1-2):15-22.

27 Aktas E，Kucuksezer U C，Bilgic S et al.Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity［J］.Cell Immunol，2009;254(2):149-154.

28 Piccioli D，Sbrana S，Melandri E et al.Contact-dependent stimulation and inhibition of dendritic cells by natural killer cells［J］.J Exp Med，2002;195(3):335-341.